第四節 細胞計數及活力測定

一、原理 培養的細胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好，所以要進行細胞計數。計數結果以每毫升細胞數表示。細胞計數的原理和方法與血細胞計數相同。

在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞，總細胞中活細胞所占的百分比叫做細胞活力，由組織中分離細胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細胞是否有損傷作用。復蘇后的細胞也要檢查活力，了解凍存和復蘇的效果。

用臺盼蘭染細胞，死細胞著色，活細胞不著色，從而可以區分死細胞與活細胞。利用細胞內某些酶與特定的試劑發生顯色反應，也可測定細胞相對數和相對活力。 

二、儀器、用品與試劑

1、儀器與用品：普通顯微鏡、血球計數板、試管、吸管、酶標儀（或分光光度計）

2、試劑：0.4％臺盼蘭，0.5％四甲基偶氮唑鹽（MTT）、酸化異丙醇

3、材料：細胞懸液

三、操作步驟

（一）細胞計數

1、將血球計數板及蓋片用擦試干凈，并將蓋片蓋在計數板上。

2、將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數板之間。

3、靜置3分鐘。

4、鏡下觀察，計算計數板四大格細胞總數，壓線細胞只計左側和上方的。然后按下式計算：

細胞數/ml＝4大格細胞總數/ 4×10000

注意：鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算，若細胞團占10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。

（二）細胞活力

1、將細胞懸液以0.5ml加入試管中。

2、加入0.5ml 0.4%臺盼蘭染液，染色2一3分鐘。

3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。

4、鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數，計細胞活力。

死細胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。

活力測定可以和細胞計數合起來進行，但要考慮到染液對原細胞懸液的加倍稀釋作用。

（三）MTT法測細胞相對數和相對活力

活細胞中的琥珀酸脫氫酶可使MTT分解產生蘭色結晶狀甲贊顆粒積于細胞內和細胞周圍。其量與細胞數呈正比，也與細胞活力呈正比。

l、細胞懸液以1000rpm離心10分鐘，棄上清液。

2、沉淀加入0.5－1ml MTT，吹打成懸液。

3、37℃下保溫2小時。

4、加入4—5 ml酸化異丙醇（定容）。打勻。

5、1000 rpm離心，取上清液酶標儀或分光光度計570nm比色，酸化異丙醇調零點。

注意：MTT法只能測定細胞相對數和相對活力，不能測定細胞數。

第五節 細胞的分裂指數

一、原理:體外培養細胞生長、分裂繁殖的能力，可用分裂指數來表示。它與生長曲線有一定的，如隨著分裂指數的不斷提高，細胞也就進入了指數生長期。分裂指數指細胞群體中分裂細胞所占的百分比，它是測定細胞周期的一個重要指標，也是不同實驗研究選擇細胞的重要依據。

二、儀器、用品與試劑

1、儀器與用品：CO2培養箱、普通顯微鏡、細胞培養血、蓋玻片、吸管

2、試劑：培養液、胰酶、甲醇、冰醋酸、Giemsa染液 

三、操作步驟

1、消化細胞，將細胞懸液接至內含蓋玻片的培養皿中。

2、CO2培養箱中培養48小時，使細胞長在蓋片上。

3、取出蓋片，按下列順序操作：

PBS漂洗3分鐘→甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分鐘→Giemsa液染色10分鐘→自來水沖洗。

4、蓋片晾干后反扣在載玻片上，鏡檢。

5、計算:

分裂指數=分裂細胞數/總細胞數×100%

四、注意事項;操作時動作要輕，以免使蓋片上的細胞脫落。

第六節 細胞周期的測定

一、原理:細胞周期指細胞一個世代所經歷的時間。從一次細胞分裂結束到下一次分裂結束為一個周期。細胞周期反應了細胞增殖速度。

單個細胞的周期測定可采用縮時攝影的方法，但它不能代表細胞群體的周期，故現多采用其他方法測群體周期。測定細胞周期的方法很多，有同位素標記法、細胞計數法等，這里介紹一種利用BrdU滲入測定細胞周期的方法。

BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）加入培養基后，可做為細胞DNA復制的原料，經過兩個細胞周期后，細胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2，反映在染色體上應表現為一條單體淺染。如經歷了三個周期，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細胞如果僅經歷了一個周期，則兩條單體均深染。計分裂相中各期比例，就可算出細胞周期的值。

二、儀器、用品與試劑

1、儀器、用品：同常規細胞培養

2、試劑：BrdU（1.0mg/ml），甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液

三、操作步驟

1、細胞生長至指數期時，向培養液中加入BrdU，使zui終濃度為10μg/ml。

2、44小時加秋水仙素，使每ml中含0.1μg。

3、48小時后常規消化細胞至離心管中，注意培養上清的漂浮細胞也要收集到離心管中。

4、常規染色體制片（見第三部分：染色體技術）。

5、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上，鋪上2×SSC 液，距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。

6、棄去2×SSC液，流水沖洗。

7、Giemsa液染色10分鐘，流水沖洗，晾干。

8、鏡檢100個分裂相，計*、二、三、四細胞期分裂指數。

9、計算：

細胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小時） 

第七節 培養物的污染及防止

按現代的觀念，凡是混入培養環境中對細胞生存產生有害的成分和造成細胞不純的異物都應該視為污染。根據這一概念，組織培養污染物應包括生物（真菌、細菌、病毒和支原體）、化學物質（影響細胞生存、非細胞所需的化學成分）、細胞（非同種的其他細胞）。其中一微生物zui為多見。另外，隨著使用細胞種類增多，不同細胞交叉污染，尤其是Hela細胞的污染也時有發生，從而造成細胞不純。

一、污染途徑 污染物，特別是微生物常通過下列途徑進入培養體系，造成污染

1、空氣：空氣是微生物及塵埃顆粒傳播的主要途徑。空氣流動性大，如果培養操作場地于外界隔離不嚴格或消毒不充分，外界不潔空氣很容易進入造成污染。因此，培養設施不能設在通風場所。無菌操作應在凈化臺內進行，工作時要帶口罩，以免因講話、咳嗽等使外界污染進入操作面，造成污染。

2、器材：各種培養器皿、器械消毒不*和洗刷不干凈導致污染，另外需要對培養箱進行定期消毒，防止形成污染

3、操作：實驗操作無菌觀念不強，技術不熟練，使用污染的器皿或封瓶不嚴等，都可以造成污染。培養兩種細胞以上時，操作不規范，交叉使用吸管或培養液、瓶等有可能導致細胞交叉污染。

4、血清：有些血清在生產時就已經被支原體或病毒等污染，變成了污染。

5、組織樣本：原代培養的污染多數來源于組織樣本；取材時碘酒消毒后脫碘不*，可造成碘混入組織，細胞或培養液中，影響細胞細胞生長。

二、污染對培養細胞的影響及污染的檢測

由于體外培養細胞自身沒有抵抗污染的能力，而且培養基中的抗生素抗污染能力有限，因而培養細胞一旦發生污染多數將無法挽回。細胞污染早期或污染程度較輕時，如果能及時去除污染物，部分細胞有可能恢復、但是當污染物持續存在培養環境中，輕者細胞生長緩慢，分類象減少，細胞變得粗糙，輪廓增強細胞漿出現顆粒、污染較嚴重，細胞增值停止，分裂象消失，細胞質中出現大量堆積物，細胞變圓、脫壁。

（一）細菌污染對培養細胞的影響及污染物的檢測

常見的污染細菌有大腸桿菌、假單孢菌、葡萄球菌等。細菌污染初期由于培養體系的抗生素作用， 其繁殖處于抑制狀態，細胞生長不受明顯影響，污染情況用倒置顯微鏡觀察不易判斷。懷疑培養細胞有細菌污染時，取10ml細胞懸液離心1000轉5分鐘，沉淀中加入無抗生素培養液2ml,將細胞放培養箱培養。

如果培養無真的細菌污染，24小時內可以獲得陽性結果。當污染的細菌量比較大或者細菌增殖到一定基數時，大約每20分鐘一代，會使培養系統中很快產生大量細菌，后者不僅可以消耗培養系統中的養分，還能釋放大量代謝產物。幾個小時后，增殖的細菌就可以導致培養液外觀渾濁，肉眼就可以判斷。細菌污染大多數可以改變培養液pH，使培養液變渾濁、變色。用相差顯微鏡觀察，可見滿視野都是點狀的細菌顆粒，原來的清晰培養背景變得模糊，大量的細菌甚至可以覆蓋細胞，對細胞的生存構成威脅。用青霉素、鏈霉素可以預防細菌污染有效。

（二）真菌污染對細胞的影響及污染物的檢測

微生物污染中以真菌zui多，真菌種類繁多，形態各異，但是污染后易于發現，大多呈白色或淺黃色小點漂浮于培養液表面，肉眼可見；有的散在生長，鏡下可見呈絲狀、管狀、樹枝狀，縱橫交錯穿行于細胞之間。念珠菌和酵母菌卵圓形，散在細胞周邊和細胞之間生長。真菌生長迅速，能在短時間內抑制細胞生長、產生有毒物質殺死細胞。抗真菌制劑對預防和排除真菌污染有效。

（三）支原體污染對細胞影響及污染物的檢測

細胞培養（特別是傳代細胞）被支原體污染是個世界性問題,是細胞培養zui常見的、干擾試驗結果的一種污染。但由于不易被察覺，有些污染的細胞仍在被應用。研究表明，95％以上是以下四種：口腔支原體（M.orale）、精氨酸支原體（M.arginini）、豬鼻支原體（M.hyorhinis）和萊氏無膽甾原體（A.laidlawii），為牛源性。以上是zui常見的污染細胞培養的支原體菌群，但能夠污染細胞的支原體種類是很多的，國外調查證明，大約有二十多種支原體能污染細胞，有的細胞株可以同時污染兩種以上的支原體。據查，目前各實驗室使用的二倍體細胞和傳代細胞中約有11%的細胞受到支原體污染。

污染來源包括工作環境污染、操作者本身污染（一些支原體在人體是正常菌群）、培養基污染、污染支原體的細胞造成的交叉污染、實驗器材帶來的污染和用來制備細胞的原始組織或器官的污染。支原體污染后，因為它們不會使細胞死亡可以與細胞長期共存，培養基一般不發生渾濁，細胞無明顯變化，外觀上給人以正常感覺，實則細胞手到多方面潛在影響，如引起細胞變形，影響DNA合成，抑制細胞生長等。

細胞培養中，主要從以下幾個方面來預防支原體的污染：

控制環境污染；

嚴格實驗操作；

細胞培養基和器材要保證無菌；

在細胞培養基中加入適量的抗生素。

支原體污染細胞后，特別是重要的細胞株，有必要清除支原體，常用方法有抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補體聯合處理。支原體zui突出的結構特征是沒有細胞壁，一般來講，對作用于細胞壁生物合成的抗生素，如 -內酰胺類、萬古霉素等*不敏感；對多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺藥物普遍耐藥。對支原體zui有抑制活性及常用于支原體感染治療的抗生素是四環素類、大環內酯類及一些氟喹諾酮；其他類抗生素如氨基糖苷類、氯霉素對支原體有較小抑制作用，所以常不用來作為支原體感染的化學治療劑。 

（四）細胞交叉污染對細胞的影響及污染物的檢測

細胞培養中，細胞間交叉污染并不罕見，多是由于在培養中操作時各種細胞同時進行，混雜使用器皿和液體所致，這種污染能使細胞的生長特性、形態特征等發生變化，有些變化較輕、不易察覺，有些可能由于污染的細胞具有生長優勢zui終壓過原來細胞而導致細胞的生長抑制，zui終死亡。常用觀察細胞形態學、分析生長特性和核型、檢測細胞的標記物等方法檢測交叉污染的細胞。

三、污染的預防:防止污染，預防是關鍵，預防措施應該貫穿整個細胞培養的始終。

1、器皿準備中的預防：用于細胞培養的器皿應該嚴格消毒，做到真正潔凈；應該無菌的物品，要做到消毒嚴格、真正無菌；器皿的運輸、貯存過程中，要嚴格操作，謹防污染。

2、開始操作前的預防：應當按廠家規定，定期清洗或更換超凈臺的空氣濾網，請專職人員定期檢查超凈臺的空氣凈化標準；檢查培養皿是否有消毒標志，有條件得實驗室可以使用一次性用品；檢查新配置的培養液，確認無菌方可使用；操作前提前半小時啟動超凈臺的紫外燈消毒；操作應戴口罩，消毒雙手。

3、操作過程中的預防；主要包括：超凈臺內放置的所有培養瓶瓶口不能與風向相逆，不允許用手觸及器皿的無菌部分，如瓶口和瓶塞內側；在安裝吸管冒、開啟或封閉瓶口操作時要經過酒精燈燒灼，并在火焰附件工作；吸取培養液、細胞懸液等液體時，應專管，防止污染擴大或造成培養物的交叉污染；使用培養液前，不易較早開啟瓶口；開瓶后的培養瓶應保持斜位，避免直立；不再使用的培養液應立即封口；培養的細胞在處理之前不要過早的暴露空氣中；操作時不要交談、咳嗽，以防唾沫和呼出氣流引發污染；操作完畢后應將工作臺面整理好，并消毒擦拭工作面，關閉超凈臺。

4、其他預防：及早凍存培養物；重要的細胞株傳代工作應有兩個人獨立進行；購入的未滅活血清應采取56度水浴滅活30分鐘使血清的補體和支原體滅活；為了避免誘導抗藥細菌，應定期更換培養系統的抗生素，或盡可能不用抗生素；對新購入的細胞株應加強觀察，防止外來的污染源；定期消毒培養箱。

四、污染的排除:培養的細胞一旦污染應及時處理，防止污染其他細胞。通常選高壓滅菌被污染的細胞，然后棄掉。如果有價值的細胞被污染，并且污染程度較輕，可以通過及時排除污染物，挽救細胞恢復正常。常用的排除微生物污染的方法有以下幾種：

1、抗生素排除法：抗生素是細胞培養中殺滅細菌的主要手段。各種抗生素性質不同，對微生物作用也不同，聯合應用比單用效果好，預防性應用比污染后應用好；如果發生微生物污染后再使用抗生素，常難以*。有的抗生素對細菌僅有抑制作用，無殺滅效應。反復使用抗生素還能使微生物產生耐藥性，而且對細胞本身也有一定影響，因此有人主張盡量不用抗生素處理，當然，一些有價值的細胞被污染后，仍需要用抗生素挽救，在這種情況下，可采用5－10倍于常用量的沖擊法，加入高濃度抗生素后作用24－48小時，再換入常規的培養液，有時可以奏效。

2、加溫除菌：根據支原體耐熱性能差的特點。有人將受支原體污染的細胞置于41度中作用5－10小時（zui長可以達18小時）殺滅支原體。但是41度對細胞本身應有較大影響，故在處理前，應*行預試驗，確定zui大限度殺傷支原體而對細胞影響較小的處理時間。

3、動物體內接種：受微生物污染的腫瘤細胞可以接種到同種動物皮下或腹腔，借動物體內免疫系統消滅掉微生物，腫瘤細胞卻能在體內生長，待一定時間，從體內取出再進行培養繁殖。

4、與巨噬細胞共培養：在良好的體外培養條件下巨噬細胞可以存活7－10天，并可以分泌一些細胞因子支持其他細胞的科隆生長。與體內情況相似，巨噬細胞在體外條件下仍然可以吞噬微生物并將其消化。利用96孔板將極少培養細胞與巨噬細胞共培養，可以在高度稀釋培養細胞、極大地降低微生物污染程度地同時，更有效地發揮巨噬細胞清除污染地效能。本方法與抗生素聯合應用效果更佳。