*節 培養細胞的細胞生物學

一、基本概念通常，體外培養的生物成分無外乎兩種結構形式：

其一是小塊組織或稱為組織塊（tissue block），一般稱為外植塊；

其二是將生物組織分散后制成的單個細胞，一般稱為分離的細胞(isolated cell)或者分散的細胞(dissociated cell)。

分散的過程通常在培養液或平衡鹽溶液中進行，分散的細胞被懸浮于培養液或平衡鹽溶液中。

單個細胞分散存在于培養液或其它平衡鹽溶液中、緩沖溶液中，就稱為細胞懸液(cell suspension)。

狹義的細胞培養(cell culture)主要是指分離（散）細胞培養，廣義的細胞培養的概念還包括單（個）細胞培養(single cell culture)。一種是群體培養（mass culture），將含有一定數量細胞的懸液置于培養瓶中，讓細胞貼壁生長，匯合（confluence）后形成均勻的單細胞層；另一種是克隆培養（clonal culture），將高度稀釋的游離細胞懸液加入培養瓶中，各個細胞貼壁后，彼此距離較遠，經過生長增殖每一個細胞形成一個細胞集落，稱為克隆（clone）。一個細胞克隆中的所有細胞均來源于同一個祖先細胞。

現今，用于疫苗生產的細胞基本有3類，即原代細胞、二倍體細胞株及傳代細胞系。經過幾十年的研究和發展，目前我國已經擁有了可以進行大規模疫苗生產的動物原代細胞、二倍體細胞和Vero細胞等生產技術，用于生產多種人用、動物疫苗。其中二倍體細胞（如我國70年代建立的人胚肺二倍體細胞株KMB17和2BS）對多種病毒具有廣泛的敏感性，用其制備病毒性疫苗可以克服使用原代細胞時在其培養物中可能存在的各種潛在致病因子的，是當前病毒性疫苗生產較為理想的細胞基質。Vero細胞是1962年由日本Chiba大學的Yasumura等人從成年非洲綠猴腎中分離獲得的，是一種貼壁依賴性成纖維細胞，核型為2n 60，高倍體率約為1.7%，可持續地進行培養，不含任何污染因子。通常使用199培養基添加5%胎牛血清進行培養。該細胞可用于多種病毒的增殖，已被WHO批準廣泛用于人用、動物用疫苗生產。 

二、體外培養細胞的分型

（一）貼附型：大多數培養細胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細胞，大致分成以下四型：

1、成纖維細胞型：胞體呈梭型或不規則三角形，*有卵圓形核，胞質突起，生長時呈放射狀。除真正的成纖維細胞外，凡由中胚層間充質起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內皮等常呈本型狀態。培養中細胞的形態與成纖維類似時皆可稱之為成纖維細胞。

2、上皮型細胞：細胞呈扁平不規則多角形，*有圓形核，細胞彼此緊密相連成單層膜。生長時呈膜狀移動，處于膜邊緣的細胞總與膜相連，很少單獨行動。起源于內、外胚層的細胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態。

3、游走細胞型：呈散在生長，一般不連成片，胞質常突起，呈活躍游走或變形運動，方向不規則。此型細胞不穩定，有時難以和其他細胞相區別。

4、多型細胞型：有一些細胞，如神經細胞難以確定其規律和穩定的形態，可統歸于此類。

（二）懸浮型:見于少數特殊的細胞，如某些類型的癌細胞及白血病細胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細胞容易大量繁殖。

三、培養細胞的生長和增殖過程:體內細胞生長在動態平衡環境中，而組織培養細胞的生存環境是培養瓶、皿或其它容器，生存空間和營養是有限的。當細胞增殖達到一定密度后，則需要分離出一部分細胞和更新營養液，否則將影響細胞的繼續生存，這一過程叫傳代（Passage或Subculture）。每次傳代以后，細胞的生長和增殖過程都會受一定的影響。另外，很多細胞在體外的生存也不是無限的，存在著一個發展過程。所有這一切，使組織細胞在培養中有著一系列與體內不同的生存特點。

（一）培養細胞生命期（Life Span of Culture Cells）:所謂培養細胞生命期，是指細胞在培養中持續增殖和生長的時間。體內組織細胞的生存期與完整機體的死亡衰老基本相一致。人胚二倍體成纖維細胞培養，在不凍存和反復傳代條件下，可傳30～50代，相當于150～300個細胞增殖周期，能維待一年左右的生存時間，zui后衰老凋亡（Apoptosis）。如供體為成體或衰老個體，則生存時間較短；如培養的為其它細胞,如肝細胞或腎細胞，生存時間更短，僅能傳幾代或十幾代。只有當細胞發生遺傳性改變，如獲永生性或惡性轉化時，細胞的生存期才可能發生改變。正常細胞培養時，不論細胞的種類和供體的年齡如何，在細胞全生存過程中，大致都經歷以下三個階段：

1、原代培養（Primary Culture）期：也稱初代培養，即從體內取出組織接種培養到*次傳代階段，一般持續1一4周。此期細胞呈活躍的移動，可見細胞分裂，但不旺盛。初代培養細胞與體內原組織在形態結構和功能活動上相似性大。細胞群是異質的（Heterogeneous），也即各細胞的遺傳性狀互不相同，細胞相互依存性強。

2、傳代期：初代培養細胞一經傳代后便改稱做細胞系（Cell Line）。在全生命期中此期的持續時間zui長。在培養條件較好情況下，細胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細胞稱二倍體細胞系（Diploid Cell Line）。為保持二倍體細胞性質，細胞應在初代培養期或傳代后早期凍存。當前世界上常用細胞均在不出十代內凍存。如不凍存，則需反復傳代以維持細胞的適宜密度，以利于生存。但這樣就有可能導致細胞失掉二倍體性質或發生轉化。一般情況下當傳代10～50次左右，細胞增殖逐漸緩慢，以至*停止，細胞進入第三期。

3、衰退期：此期細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細胞形態輪廓增強，zui后衰退凋亡。

在細胞生命期階段，少數情況下，在以上三期任何一點（多發生在傳代末或衰退期），由于某種因素的影響，細胞可能發生自發轉化（Spontaneous Transformation）。轉化的標志之一是細胞可能獲得永生性（Immortality）或惡性性（Malignancy）。細胞永生性也稱不死性，即細胞獲持久性增殖能力，這樣的細胞群體稱無限細胞系（Infinite Cell Line），也稱連續細胞系（Continuous Cell Line）。無限細胞系的形成主要發生在第二期末，或第三期初階段。細胞獲不死性后，核型大多變成異倍體（Heteroploid）。細胞轉化亦可用人工方法誘發，轉化后的細胞也可能具有惡性性質。細胞永生性和惡性性非同一性狀。

（二）組織培養細胞一代生存期 所有體外培養細胞，包括初代培養及各種細胞系，當生長達到一定密度后，都需做傳代處理。傳代的頻率或間隔與培養液的性質、接種細胞數量和細胞增殖速度等有關。接種細胞數量大、細胞基數大、相同增殖速度條件下，細胞數量增加與飽和速度相對要快（實際上細胞接種數量大時細胞增殖速度比時要快）。連續細胞系和腫瘤細胞系比初代培養細胞增殖快，培養液中血清含量多時細胞增殖比少時快。以上情況都會縮短傳代時間。

所謂細胞“一代”一詞，系僅指從細胞接種到分離再培養時的一段時間，這已成為培養工作中的一種習慣說法，它與細胞倍增一代非同一含義。如某一細胞系為第153代細胞，即指該細胞系已傳代153次。它與細胞世代（Generation）或倍增〔Doubling〕不同；在細胞一代中，細胞能倍增3～6次。

細胞傳一代后，一般要經過以下三個階段：

1、潛伏期（Latent Phase）：細胞接種培養后，先經過一個在培養液中呈懸浮狀態的懸浮期。此時細胞胞質回縮，胞體呈圓球形。接著是細胞附著或貼附于底物表面上，稱貼壁，懸浮期結束。各種細胞貼附速度不同，這與細胞的種類、培養基成分和底物的理化性質等密切相關。初代培養細胞貼附慢，可長達10～24小時或更多；連續細胞系和惡性細胞系快，10～30分鐘即可貼附。細胞貼附現象是一個非常復雜和與多種因素相關的過程。支持物能影響細胞的貼附；底物表面不潔不利貼附，底物表面帶有陽性電荷利于貼附。另外在貼附過程中，有一些特殊物質如纖維連接素（Fibronectin），又稱LETS（Larger External Transformation Substance），細胞表面蛋白（Cell Surface Protein：CSP）等也參與貼附過程。這些物質都是蛋白類成分，它們有的存在于細胞膜的表面（如CSP），有的則來自培養基中的血清（LETS）。近年又從各種不同組織和生物成分中提取出了很多促貼附物質。貼附是貼附類細胞生長增殖條件之一。

細胞貼附于支持物后，除先經過前述延展過程變成極性細胞，還要經過一個潛伏階段，才進入生長和增殖期。細胞處在潛伏期時，可有運動活動，基本無增殖，少見分裂相。細胞潛伏期與細胞接種密度、細胞種類和培養基性質等密切相關。初代培養細胞潛伏期長，約24～96小時或更長，連續細胞系和腫瘤細胞潛伏期短，僅6～24小時；細胞接種密度大時潛伏期短。當細胞分裂相開始出現并逐漸增多時，標志細胞已進入指數增生期。

2、指數增生期（Logarithmic growth Phase）：這是細胞增值zui旺盛的階段，細胞分裂相增多。指數增生期細胞分裂相數量可作為判定細胞生長旺盛與否的一個重要標志。一般以細胞分裂（Mitotic Index：MI）表示，即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數。體外培養細胞分裂指數受細胞種類、培養液成分、pH、培養箱溫度等多種因素的影響。一般細胞的分裂指數介于0.1%～0.5%，初代細胞分裂指數低，連續細胞和腫瘤細胞分裂指數可高達3%～5%。pH和培養液血清含量變動對細胞分裂指數有很大影響。指數增生期是細胞一代中活力的時期，因此是進行各種實驗的和zui主要的階段。在接種細胞數量適宜情況下，指數增生期持續3～5天后，隨細胞數量不斷增多、生長空間漸趨減少、zui后細胞相互接觸匯合成片。細胞相互接觸后，如培養的是正常細胞，由于細胞的相互接觸能抑制細胞的運動，這種現象稱接觸抑制（Contact Inhibition）。而惡性細胞則無接觸抑制現象，因此接觸抑制可作為區別正常與癌細胞標志之一。腫瘤細胞由于無接觸抑制能繼續移動和增殖，導致細胞向三維空間擴展，使細胞發生堆積（Piled up）。細胞接觸匯合成片后，雖發生接觸抑制，只要營養充分，細胞仍然能夠進行增殖分裂，因此細胞數量仍在增多。但當細胞密度進一步增大，培養液中營養成分減少，代謝產物增多時，細胞因營養的枯竭和代謝物的影響，則發生密度抑制（Density Inhibition），導致細胞分裂停止。因此細胞接觸抑制和密度抑制是兩個不同的概念，不應混淆。

3、停滯期（Stagnate Phase）：細胞數量達飽和密度后，細胞遂停止增殖，進入停滯期。此時細胞數量不再增加，故也稱平頂期（Plateau）。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養液中營養漸趨耗盡，代謝產物積累、pH降低。此時需做分離培養即傳代，否則細胞會中毒，發生形態改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應越早越好。傳代過晚（已有中毒跡象）能影響下一代細胞的機能狀態。在這種情況下，雖進行了傳代，因細胞已受損，需要恢復，至少還要再傳1～2兩代，通過換液淘汰掉死細胞和使受損輕微的細胞得以恢復后，才能再用。結果反而耽誤了時間，這是在實驗中應特別注意的。

四、原代培養:即*次培養，是指將培養物放置在體外生長環境中持續培養，中途不分割培養物的培養過程。有幾方面含義：

培養物一經接種到培養器皿（瓶）中就不在分割，任其生長繁殖；

原代培養中的“代”并非細胞的“代”數，因為培養過程中細胞經多次分裂已經產生多代子細胞； 

原代培養過程中不分割培養物不等于不更換培養液，也不等于不更換培養器皿。

正常細胞培養的世代數有限，只有癌細胞和發生轉化的細胞才能無限生長下去。所謂轉化即是指正常細胞在某種因子的作用下發生突變而具有癌性的細胞。目前世界上許多實驗室所廣泛傳用的HeLa細胞系就是1951年從一位名叫Henrietta Lacks的婦女身上取下的宮頸癌細胞培養而成。此細胞系一直延用至今。

原代培養的細胞一般傳至10代左右就不易傳下去了，細胞的生長就會出現停滯，大部分細胞衰老死亡。但是有極少數的細胞能夠度過“危機”而繼續傳下去，這些存活的細胞一般能夠傳到40～50代，這種傳代細胞叫做細胞株。細胞株的遺傳物質沒有發生改變,在培養過程中其特征始終保持。當細胞株傳至50代以后又會出現“危機”，不能再傳下去。但是有部分細胞的遺傳物質發生了改變，并且帶有癌變的特點，有可能在培養條件下無限制地傳代下去，這種傳代細胞稱為細胞系。

原代培養是建立各種細胞系（株）必經的階段，其是否成功與組織污染與否、供體年齡、培養技術和方法、適宜培養基的選擇等多種因素有關。由于原代培養的細胞轉化性極小，對病毒敏感性好，因此適應制備疫苗等生物制品；但也存在有潛在外源因子、不能事先檢查標本、且受供體年齡健康狀況的影響而導致批間差異大等缺陷。目前常用的原代細胞培養有雞胚成纖維細胞及豬腎、猴腎、地鼠腎等原代細胞。

原代培養的基本過程包括取材、培養材料的制備、接種、加培養液、置培養條件下培養等步驟，在所有的操作過程中，都必須保持培養物及生長環境的無菌。

多數情況下，分散的細胞若屬于貼壁依賴型細胞，就能黏附、鋪展于培養器皿和載體表面生長而形成細胞單層，這種培養方式稱為單層細胞培養（monolayer culture），又叫貼壁培養（adherent culture）。少數情況下，培養的細胞沒有貼壁依賴性，可通過專門設備使細胞始終處于懸狀態而在體外生長，這種形式稱為懸浮培養（suspension culture）。如何讓接種的細胞盡快貼壁，是決定培養成功的關鍵步驟：

取決于適當的生長基質表面；

可降低接種后培養液對細胞的浮力，如先少補加少量培養液，待細胞貼壁后再補足營養液繼續培養；

注意適當的細胞接種密度，一般105個/ml左右。

五、傳代培養:當原代培養成功以后，隨著培養時間的延長和細胞不斷分裂，一則細胞之間相互接觸而發生接觸性抑制，生長速度減慢甚至停止；另一方面也會因營養物不足和代謝物積累而不利于生長或發生中毒。此時就需要將培養物分割成小的部分，重新接種到另外的培養器皿（瓶）內，再進行培養。這個過程就稱為傳代（passage）或者再培養（subculture）。對單層培養而言，80%匯合或剛匯合的細胞是較理想的傳代階段。

體外培養技術中所謂的傳“代”概念并不等于細胞生物學中“親代細胞”與“子代細胞”中“代”的概念。傳代培養的實質就是分割后再一次培養，可以相對地衡量培養物的培養年齡。

六、生長曲線:細胞接種入培養瓶后，*入2-24h的延遲期（lag period），然后進入指數生長期（即對數期）（log phase），匯合成單層進入緩慢生長或停滯期（即平臺期）（plateau lhase）。每種細胞系（cell line）的這些生長期（growth phase）都是特征性的，只要環境條件保持恒定，每一次測定結果應該是可重復的。

第二節 細胞分離技術

一、從原代組織中分離細胞 將組織塊分離（散）成細胞懸液的方法有多種，zui常用的是機械解離細胞法、酶學解離細胞法以及螯合劑解離細胞法。

從原代組織中獲得單細胞懸液的一般方法是酶解聚。細胞暴露在酶中的時間要盡可能的短，以保持zui大的活性。下列步驟可以解聚整個組織，獲得較高產量的有活性細胞。

1、胰蛋白酶 (Trypsin)

在去除不需要的組織后，使用無菌的解剖刀和剪子把剩余的組織切成3~4mm小片，通過懸浮在無鈣鎂的平衡鹽溶液中清洗組織碎片。讓組織碎片沉淀，去除上清液。重復清洗2到3次。

將盛有組織碎片的容器置于冰上，去除殘留的上清液。加入0.25％溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液中的胰蛋白酶（100mg組織加入1ml 胰蛋白酶）。

在4℃孵育6到18小時，使幾乎沒有胰蛋白酶活性的酶盡可能滲透進去。

移棄組織碎片中的胰蛋白酶，在37℃孵育包含殘留胰蛋白酶的組織碎片20到30分鐘。

在組織碎片加入熱的*培養基，用移液管輕輕地分散組織。如果使用無血清培養基，要加入大豆胰蛋白酶抑制劑。

通過無菌不銹鋼絲網（100～200mm）過濾，分散所有剩余組織。計數和接種細胞，進行培養。 

2、膠原酶 (Collagenase)

用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4mm小片，用Hanks'平衡液（HBSS）清洗組織碎片幾次。

加入膠原酶（50～200單位/ml，溶解在HBSS中）。

在37℃孵育4到18小時。加入3mM CaCl2增加解離效率。

通過無菌不銹鋼絲網或尼龍網過濾細胞懸液，以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進一步的解聚，在碎片中加入新鮮的膠原酶。

通過離心在HBSS中清洗懸液幾次。

再一次在培養基中懸浮細胞，計數和接種細胞，進行培養。

3、Dispase

用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4mm小片，用不含鈣鎂的平衡鹽溶液清洗組織碎片幾次。

加入Dispase（0.6～2.4單位/ml 溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液）

在37℃孵育20分鐘到幾個小時。

通過無菌不銹鋼絲網或尼龍網過濾細胞懸液，以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進一步的解聚，在碎片中加入新鮮的Dispase。

通過離心在平衡鹽溶液中清洗懸液幾次。

再一次在培養基中懸浮細胞，計數和接種細胞，進行培養。

二、從原培養容器中分離細胞:以下是從基層迅速分離細胞，且保持細胞完整性的一般步驟。這一步驟并不意味著對于所有細胞系的廣泛應用，每一種系統*條件和施用濃度應該根據經驗加以確定。

再次培養時檢測細胞的活性。

細胞的活率應該超過90％

對于無血清培養基，降低胰蛋白酶使用量。

1、移棄使用過的細胞培養基。

2、使用不包含有鈣鎂的平衡鹽溶液或EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸.)清洗細胞（看表確定正確的清洗溶液）。在培養瓶對著細胞的一面加入清洗溶液，通過轉動培養瓶1到2分鐘清洗細胞層，然后去除清洗液。

3、以2～3ml/25cm2的量，加選擇的分離液(見表)到培養瓶對著細胞的一面。確保分離液覆蓋細胞層。在37℃孵育培養瓶，輕輕搖動培養瓶。通常，在5到15分鐘內，細胞就會脫落。細胞分離需要的時間因細胞系不同而有所變化。仔細監測細胞分離過程，避免細胞受損傷。對難于從培養瓶基層分離的細胞系，可以輕輕敲打，以加速分離過程。

4、當細胞*分離時，垂直放置培養瓶，讓細胞流到培養瓶的底部。在培養瓶中加入*培養基，通過移液管在單層細胞表面反復吹打來分散細胞。計數并再次培養細胞。

5、對于無血清培養基，加入大豆胰蛋白酶抑制劑。通常使用1∶1（v∶v）0.25mg/ml胰蛋白酶抑制劑到胰蛋白酶中將抑制胰蛋白酶活性。

第三節 細胞的凍存與復蘇

為了防止因污染或技術原因使長期培養功虧一簣，考慮到培養細胞因傳代而遲早會出現變異，有時因寄贈、交換和購買，培養細胞從一個實驗室轉運到另一個實驗室，*的策略是進行低溫保存。這對于維持一些特殊細胞株的遺傳特性極為重要。現簡要介紹深低溫保存法(－70℃~－196℃)的特點。細胞深低溫保存的基本原理是：在－70℃以下時，細胞內的酶活性均己停止，即代謝處于*停止狀態，故可以長期保存。細胞低溫保存的關鍵，在于通過0~20℃階段的處理過程。在此溫度范圍內，水晶呈針狀，極易招致細胞的嚴重損傷。

一、細胞的凍存:為避免污染造成的損失，zui小化連續細胞系的遺傳改變和避免有限細胞系的老化和轉化，需要凍存哺乳細胞。凍存細胞前，細胞應該特性化并檢查是否污染。 

有幾種普通培養基用來凍存細胞。對于包含有血清的培養基，成分可能如下：

包含10％甘油的*培養基，

包含10％二甲基亞砜（DMSO）的*培養基，

50％ 細胞條件培養基和50％含有10％甘油的新鮮培養基，或

50％ 細胞條件培養基和50％含有10％二甲基亞砜的新鮮培養基。

對于無血清培養基，一些普通的培養基成分可能是：

50％ 細胞條件無血清培養基和50％包含有7.5％二甲基亞砜的新鮮的無血清培養基，或

包含有7.5％二甲基亞砜和10％細胞培養級BSA的新鮮無血清培養基。

1、懸浮細胞

計數將要凍存的活細胞。細胞應該處于對數生長期。以大約200～400g離心5分鐘沉淀細胞，使用移液管移去上清到zui小體積，不要攪亂細胞。

以1×107到5×107細胞/ml密度，在包含有血清的冷凍培養基中再次懸浮細胞，或者以0.5×107到1×107在無血清培養基中，再次懸浮細胞。

分裝進凍存管，將凍存管置于濕冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內開始冷凍步驟。

細胞以1℃/分鐘進行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉移到液氮中貯存。

2、貼壁細胞

使用分離試劑從基層分離細胞，分離時盡可能溫和，使對細胞的損傷減少到zui小。

在*生長培養基中，再次懸浮分離細胞，確定有活力細胞數。

以大約200g離心5分鐘沉淀細胞。使用移液管移去上清到zui小體積，不要攪亂細胞。

以5×106到1×106細胞/ml密度，在凍存液中懸浮細胞。

分裝進凍存管，將凍存管置于濕的冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內開始冷凍步驟。

細胞以1℃/分鐘進行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉移到液氮中貯存。

二、凍存細胞的復蘇:凍存細胞較脆弱，要輕柔操作。凍存細胞要快速融化，并直接加入*生長培養基中。若細胞對凍存劑（DMSO或甘油）敏感，離心去除凍存培養基，然后加入*生長培養基中。

1、直接鋪板方法

取出貯存細胞，37℃水浴中快速融化。

直接用*生長培養基鋪板細胞。1ml凍存細胞使用10~20ml*生長培養基。進行活細胞計數，細胞接種應該至少在3×105活細胞/ml。

培養細胞12到24小時，更換新鮮的*生長培養基，去除凍存劑。 

2、離心方法

取出貯存細胞，37℃水浴中快速融化。

把1到2ml凍存細胞加入到大約25ml*生長培養基，輕輕混勻。

以大約80x g離心2到3分鐘。

棄去上清。

在*生長培養基輕輕再次懸浮細胞，并且進行活細胞計數。

細胞鋪板，細胞接種應該至少為3×105活細胞/ml。

三、細胞的分化、衰老與死亡

1、細胞的分化:一個成年人全身細胞總數約1012個，可以區分為200多種不同類型的細胞：形態結構，代謝，行為，功能等各不相同。追根溯源，這么多種細胞均來自一個受精卵細胞。所以，通常把發育過程中，細胞后代在形態、結構和功能上發生差異的過程稱為細胞分化。細胞分化發生在胚胎階段，也發生在胎兒出生以后，乃至成人階段。例如，人體血細胞的產生和分化，這個過程在人的一生中一直持續著。

由旺盛生長不斷分裂的細胞，轉入分化，通常從細胞周期中G1期開始時一個確定的點G0點“逃逸”出細胞周期。旺盛生長分裂的細胞和各種分化了的細胞，它們的基因表達和代謝活動各不相同。

2、細胞的衰老:體外細胞培養實驗證明：

成纖維細胞：來自胎兒傳代50次后衰老死亡,來自成人傳代20次后衰老死亡(與具體年齡有關);來自小鼠傳代14--28次后衰老死亡,來自烏龜傳代90--125次后衰老死亡。

細胞衰老過程中會發生一系列的變化，包括：蛋白質合成速度降低，已有蛋白質結構變化，特異蛋白質成份出現；同時，細胞核，線粒體，膜系統、骨架系統等都有結構、功能的改變。

細胞衰老原因，尚無定論，出現過好幾種理論與假說，其中得到較廣泛認可的是“自由基損傷假說”。

3、細胞凋亡:細胞的死亡是個體存活的正常現象，常見的細胞死亡形式有3種：壞死、凋亡和細胞毒性。多細胞生物的生命活動中，因為環境因素的突然變化或病原物的入侵，導致一部分細胞死亡，稱為細胞的病理死亡，或細胞壞死。壞死是細胞暴露于嚴重的物理或化學刺激時導致的細胞死亡；細胞毒性是由細胞或者化學物質引起的單純的細胞殺傷事件，不依賴于其它兩種細胞死亡機理，如殺傷T細胞的細胞毒性作用。

還有一種情況，一部分細胞的死亡是生物個體正常生命活動（代謝、生長、發育、分化）的一個必要部分；似乎帶有“犧牲局部，保全整體”的意味。這種情況下的細胞死亡，明顯地受遺傳控制，稱為細胞凋亡。 凋亡（Apoptosis）則是程序性的、正常的細胞死亡，是機體清除無用的或者不想要的細胞的手段。它與細胞壞死是兩個截然不同的過程，無論從形態學、生物學還是生化的特征來說，都有明顯的區別。細胞凋亡現象普遍存在于生物界。細胞凋亡與細胞增殖、分化和衰老起著互補與平衡的作用，在多細胞動物的發育、形態建成與維持中扮演至關重要的角色。作為細胞的一種基本生命現象，凋亡失控的結果將是可怕的：凋亡不足時，易發生癌變、病毒性疾病和自身免疫疾病；而凋亡過量則可能產生獲得性免疫缺陷綜合征（HIV）、重癥肝炎與退行性神經疾病，如老年性癡呆癥（Alzheimer's disease）、帕金森氏癥（Parkinson's disease）。因此研究細胞凋亡及其機理具有重要的理論和實踐意義。

細胞凋亡與壞死的區別

壞死 ：

形態學特征-膜完整性喪失,胞漿和線粒體膨脹 ,全細胞裂解

生化特征-離子內環境失調,非能量依賴性的（被動過程，在4°C也可以發生）,隨機消化DNA（電泳顯示為DNA彌散狀態）,Postlytic DNA斷裂

生理學特征-影響群組細胞 由非生理學因素引起（如補體攻擊、代謝中毒、缺氧等）,被巨噬細胞吞噬, 周圍有明顯的炎癥反應

凋亡 ：

形態學特征-胞膜出芽，但保持完整,染色體聚集在核膜周邊,胞漿收縮、細胞核凝集,zui后細胞分裂為凋亡小體,Bcl-2家族蛋白導致線粒體膜通透性增加

生化特征--ATP依賴性的（主動過程，在4°C不能發生）,以核小體為單位剪切DNA（電泳顯示為DNA ladder）,Prelytic DNA 斷裂,線粒體釋放多種因子至胞漿中（細胞色素c、AIF）,Caspases級聯活化,膜對稱性改變（PS外翻）

生理學特征--只影響單個細胞 ,由生理學刺激誘導（如生長因子缺乏、激素環境改變等）,被臨近細胞和巨噬細胞吞噬 無炎癥反應