人血清白蛋白(人血漿白蛋白)存在于人體血漿中,占血清蛋白質的55-63%,是血清中少數不含糖的蛋白質之一,分子量67.5kD,由585個氨基酸殘基組成的單鏈多肽,分子中含17個二硫鍵,等電點為4.9。具有增加血容量和維持血漿膠體滲透壓、運輸和解毒以及營養共給的功能。
EPO(重組人促紅細胞生成素)由腎皮質腎小管周圍間質細胞和肝臟分泌的一種激素樣物質,能夠促進紅細胞生成。其為酸性糖蛋白,疏水性強,含有165個氨基酸,相對分子質量約為34 kD(30-39kD),其中糖鏈約占39%,兩個鏈內二硫鍵,等電點為3.75-4.15。醫療用途:增加紅血球的數目,用于貧血、組織斷離等治療;體育用途:增加訓練耐力和訓練負荷,屬于國際奧委會規定的違禁藥物。
本文采用離子交換液相色譜方法和空間排阻色譜法對人血白蛋白和EPO分離。各種不同分離方法色譜條件見表2-18,各分離模式下柱溫均為30 ℃,進樣量10 µL,檢測波長280 nm。分析圖譜見圖2-25到2-26
(1)體積排阻色譜條件:色譜柱:Mab Pac SEC-1,5 µm,4.0×300 mm, P/N:074696流動相:1.5 mmol/L KH2PO4-3.2 mmol/L Na2HPO4-400 mmol/L NaCl,pH=7.3混合溶液流速:0.20 mL/min(2)離子交換色譜條件:色譜柱:MAb Pac WAX-10,10 µm,4.0×250 mm, P/N:054999流動相:A:10mmol/L Tris緩沖液pH=8.2; B:10mmol/L Tris緩沖液,1.0mol/L的NaCl,pH=8.2;流速:1.0 mL/min
梯度條件見表2-18;采用離子色譜法測定樣品,保留時間和峰面積的重現性非常好,含量接近標示量。同時人血白蛋白和EPO分別在0.1-10 mg/mL和0.05-1.62 mg/mL范圍內,線性關系較好,見附錄結果。因此采用陰離子交換色譜柱ProPac WAX-10在色譜條件下能夠對人血白蛋白和EPO進行很好分離分析。參照藥典的方法,采用Mab Pac SEC-1色譜柱對EPO、人白和樣品溶液進行分析,結果表明樣品溶液中,低濃度的EPO峰和高濃度的人白色譜峰重疊在一起,無法進行很好分離,主要原因可能實驗室色譜柱的體積排阻限比較寬(10-1000kD),建議采用體積排阻限符合藥典的色譜柱,結果可能會比較好。
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