2019年，國家糧食和物資儲備局辦公室在第330號通知[1]中公開了國家標準《小麥粉》征求意見稿，其中小麥粉的定義為：小麥粉wheat flour是指由普通小麥（六倍體小麥，Triticum aestivum L.）經過碾磨制粉，去除部分麩皮和胚并達到一定加工精度要求的、未添加任何物質的、能夠滿足制作面制食品要求的產品。與《關于進一步加強小麥粉質量安全監管的公告》（2017 年第132號）[2]中關于小麥粉（通用）中添加物的要求，即“取得‘小麥粉（通用）’生產許可的企業，不得在小麥粉中添加任何食品輔料”，保持一致。
早前被允許添加之后又被禁止的過氧化苯甲酰（Dibenzoyl peroxide, BPO），在近幾年的食品安全抽檢中時有被檢出，其非法添加的目的主要是給新生產的小麥粉脫色[3]。然而在小麥粉的加工和儲藏過程中，經常會出現顏色加深的現象，即褐變。發生褐變的主要原因是，小麥籽粒中的多酚氧化酶（Polyphenol oxidase, PPO）催化酚類物質氧化生成褐色或黑色的醌類物質[4]，從而影響了小麥粉的色澤，降低了小麥粉的品質。
根據GB 2760-2014 附錄B[5]中，對食品漂白劑的定義：能夠破壞、抑制食品的發色因素，使其褪色或使食品免于褐變的物質。針對小麥粉的酶促褐變，一些不法的的商販會通過添加具有還原性的硫脲（Thiourea）進行漂白，硫脲能夠抑制多酚氧化酶的活性，阻止褐變的發生，在一定程度上將醌類還原成酚類，掩蓋不好的品質，達到提亮增白的效果。而硫脲的非法添加會刺激呼吸道和腸道，抑制甲狀腺和造血器官的機能，引起咳嗽、胸悶、頭痛、嗜睡、無力、面色蒼白、面部虛腫、基礎代謝降低、血壓下降、脈搏變慢、白細胞減少等癥狀[6]。早在2001年，世界衛生組織國際癌癥研究機構就將硫脲列在了3類致癌物清單中。
原食品藥品監督管理總局于2016年發布第196號公告[7]，公布了食品補充檢驗方法《小麥粉中硫脲的測定 BJS 201602》，補 了充國內硫脲檢測標準。為了進一步規范企業的生產行為，加強小麥粉質量安全監管，總局于2017年發布第132號公告[2]，其中明確規定“嚴禁生產企業在小麥粉中添加過氧化苯甲酰、次磷酸鈉、硫脲、間苯二酚、過硫酸鹽、噻二唑、曲酸等非食品原料”。
在此背景下，賽默飛實驗室對高效液相色譜法測定小麥粉中硫脲的實驗條件，開展了相關研究工作。
01樣品前處理
準確稱取均質小麥粉1.0 g（精確至0.01 g）于15 mL旋蓋螺口圓底離心管中，加入10.00 mL 80:20乙腈水，旋緊蓋子，渦旋分散30 s，水浴超聲提取20 min（由于超聲時間較長，水浴溫度會升高，建議加入冰袋控溫），10000 rpm 4℃ 冷凍離心10 min，取上清液過0.2 μm親水PTFE微孔濾膜，濾液上機測試。
02色譜條件
● 液相色譜儀：UltiMate™ 3000 HPLC 液相色譜系統
● 色譜柱：Syncronis™ HILIC, 250×4.6 mm, 5μm (P/N: 97505-254630)
● 柱溫：20 ℃
● 進樣量：5 µL
● 流動相：A為乙腈，B為水
● 洗脫程序：A:B=90:10，等度洗脫
● 流速：1 mL/min
● 檢測波長：246 nm
● 采樣頻率：5 Hz
● 采集時間：12 min
03實驗結果與討論
3.1色譜條件優化
3.1.1 色譜柱選擇
硫脲標準品溶液在Syncronis HILIC色譜柱上獲得了出色的峰型和優異的靈敏度。
圖1. 硫脲標準品溶液色譜圖（1.00 μg/mL）
3.1.2 樣品溶劑的選擇
在HILIC模式下，采用80:20乙腈水作為標準品稀釋液時，10.0 μg/mL硫脲標準品得到了尖銳且對稱的峰型。
圖2. 硫脲標準品溶液色譜圖（10.0 μg/mL）（A：稀釋溶劑為純水，B：稀釋溶劑為80:20乙腈水）
3.1.3 柱溫的選擇
當色譜柱柱溫選擇20 ℃ 時，硫脲峰與雜質峰可達到基線分離。同時，采集時間由10 min延長至12 min，可避免11 min左右的雜質峰延遲至下一針進樣時出峰。
圖3. 30℃ 柱溫，小麥粉空白基質和0.20 μg/mL基質加標疊加色譜圖
圖4. 20℃ 柱溫，小麥粉空白基質和0.20 μg/mL基質加標疊加色譜圖
3.2樣品前處理優化
本次試驗中前處理流程為：稱取1.00 g小麥粉，加入10.00 mL 80:20乙腈水（提取溶劑與標準品稀釋溶劑保持一致），渦旋混勻，高速冷凍離心，取上清液過膜，上機測試。處理一批次8個樣品，耗時約1小時。而標準推薦的前處理流程，在提取、過濾（離心）后，加入了旋蒸濃縮10 mL 80:20乙醇水提取液的操作，耗時較長，且樣品通量小。因此優化后的前處理流程，提高了樣品通量，減少了溶劑用量，效率得到提升。
3.3線性范圍、方法檢出限及方法定量限
在優化的色譜條件下，硫脲標準工作液線性范圍為0.20-5.00 μg/mL，線性方程y=0.9109x-0.0300，線性相關系數r2=0.99992，線性關系良好。硫脲線性方程圖及標準曲線點疊加色譜圖。在優化前處理條件下，硫脲方法檢出限為2.0 mg/kg，定量限為5.0 mg/kg。
圖5. 硫脲線性方程圖及標準曲線點疊加色譜圖
3.4回收率和精密度
小麥粉基質 2.0、5.0、20.0 mg/kg 三水平加標回收率范圍在 91.2%～95.0% 之間，相對標準偏差在 0.57%～2.36% 之間（n=6）
表1 小麥粉基質 2.0、5.0、20.0 mg/kg
三水平加標回收率范圍和精密度
圖6小麥粉基質 2.0、5.0、20.0 mg/kg 三水平加標回收率范圍和精密度
圖7小麥粉基質中硫脲方法檢出限 MDL 濃度 (2.0 mg/kg) 加標
圖8小麥粉基質中硫脲方法定量限 LOQ 濃度 (5.0 mg/kg)加標
圖9小麥粉基質中硫脲10倍方法檢出限濃度 (20.0 mg/kg)加標
04結論
本方法針對食品補充檢驗方法《小麥粉中硫脲的測定 BJS201602》進行了優化，簡化了前處理流程，優化了色譜條件，線性范圍、方法檢出限及定量限、加標回收率及精密度均能滿足方法確認的要求。該方法簡單、便捷，適用于小麥粉中非法添加物硫脲的快速測定。
參考文獻：
[1] 國家糧食和物資儲備局辦公室. 關于《小麥》《小麥粉》國家標準公開征求意見的通知 國糧辦發[2019]330號[EB/OL]. http://www.lswz.gov.cn/html/zmhd/yjzj/2019-11/11/content_247627.shtml
[2] 總局關于進一步加強小麥粉質量安全監管的公告(2017年第132號)[J]. 現代面粉工業,2017,31(06):28.
[3] 于鴻飛. 國內外小麥粉標準的差異及我國現行小麥粉標準的修訂研究[D]. 西北農林科技大學,2011.
[4] 黃海霞,張真,吳金芝. 小麥多酚氧化酶特性及褐變控制研究[J]. 安徽農業科學,2008,36(31):13574-13575,13638.
[5] GB 2760-2014. 食品安全國家標準 食品添加劑使用標準[S]. 2014
[6] 焦安浩. 硫脲的危險性及安全管理措施研究[J]. 化工管理,2021(07):95-96
[7] 總局關于發布食品中那非類物質的測定和小麥粉中硫脲的測定2項檢驗方法的公告[J]. 中國食品衛生雜志,2017,29(01):25.
[8] Thermo Fisher Scientific Technical Guide 21003:HILIC Separations Technical Guide-A Practical Guide to HILIC Mechanisms, Method Development and Troubleshooting[A/OL]. https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets/CMD/brochures/TG-21003-HILIC-Separations-TG21003-EN.pdf . 2014
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