摘 要：采用雙三元液相色譜(Dual gradient liquid chromatography,DGLC)建立了在線固相萃取技術與電噴霧 串聯質譜聯用方法(Online SPE DGLC鄄ESI MS / MS),并成功應用于實際樣品檢測。 本方法同時檢測大豆不同 部位中的 4 種酸堿性植物激素(赤霉素(GA3)、吲哚乙酸(IAA)、玉米素(ZT)和脫落酸(ABA))。 通過考察固 相萃取富集柱、分析色譜柱、流動相對植物激素的保留和選擇性的影響,獲得較高的靈敏度、回收率、穩定性及精 密度。 大豆樣品經液氮低溫研磨,以 80% 甲醇溶液提取,再經離心稀釋過濾后,進樣分析。 進樣后樣品經在線 固相萃取 Hypersep Retain AX 柱洗脫保留,目標分析物依次轉移至分析柱 Acclaim PA2 色譜柱,并以 0. 1% 甲酸 和甲醇溶液作為流動相進行梯度洗脫,采用選擇反應監測離子模式(SRM)同時采集正負離子通道進行定性分 析,基質標準曲線外標法進行定量分析,GA3, IAA, ZT 在 0. 1 ~ 50 滋g / L 范圍內線性良好,檢出限為 0. 0002 滋g / g; ABA 在 0. 5 ~ 50 滋g / L 的范圍內線性良好,其檢出限為0. 0010 滋g / g。 以 0. 8, 4. 0 和 40 滋g / L 分別 為低、中、高濃度考察 4 種植物激素的回收率為 76. 1% ~ 93. 5% ,RSD 為 0. 8% ~ 6. 0% 。 結果表明,籽粒中含有 的 ABA 濃度明顯高于其它部位。 本研究為快速準確地分離和測定大豆不同部位內源激素提供了有效方法。
1 引 言 ：赤霉素(GA3 )、吲哚乙酸(IAA)、玉米素(ZT)和脫落酸(ABA)是 4 種重要的植物內源激素,廣泛分 布在植物體內,對植物細胞的生長、分化、分裂、器官建成、植物的休眠萌發形態反應等都有直接或間接 的調節控制作用,參與植物生命的所有活動[1 ~ 3] 。 但是,內源激素因其在植物中的含量極低,基質干擾 多,使得農作物內源激素的測定十分困難,因此痕量激素的測定技術已成為制約植物激素學界研究的 大瓶頸之一,同時也是分析科學領域的研究熱點[4] 。 目前,關于農作物中內源激素測定的文獻報道多結合液相色譜技術或液相色譜鄄質譜聯用技術,進 樣前幾乎均采用固相萃取(SPE)技術去除農作物中復雜基質干擾。 顯然,固相萃取技術在復雜基體中 痕量組分分析中處于核心地位,是農作物內源激素測定較為理想的選擇[5,6] 。 已發表的文獻報道表明, 其所采用的固相萃取方法處理過程基本上還處在手工操作階段,存在過程復雜、耗材消耗量大、有毒試 劑接觸多、需要額外氮吹、重現性差、無法實現全自動聯機和通量低等問題。 本實驗所采用的在線固相 萃取技術是一種全自動的在線樣品前處理方式,是近年來商品化的儀器樣品前處理新技術。 在線聯接 可避免因復雜前處理過程而帶來的分析物損失,減少操作者因溶劑揮發與有毒溶劑的接觸,節省時間, 提高效率、可靠性和靈敏度,在線固相萃取分析越來越受到人們的重視[7,8] 。 目前,在線固相萃取技術 在農業科學領域的應用并不多見,因此本方法較已發表的關于測定植物激素的方法[9,10] 具有前處理簡 便、實驗快速、靈敏度高等優點。 植物激素包括生長素(Auxins)、赤霉素(Gibberellins)、細胞分裂素 (Cytokinins)、脫落酸(Abscisic acids) 和乙烯(Ethylene) 五類,已發表的文獻主要是考察其中某些酸 性[11]或者堿性[12]的植物激素,缺乏全面性,本研究考察的 4 種植物激素 IAA, ZT, ABA 和 GA3,分別屬 于生長素、細胞分裂素、脫落酸、赤霉素。 本方法有利于全面考察農作物中植物激素含量。
2 實驗部分 2. 1 儀器與試劑 雙三元液相色譜系統 ( 美國賽默飛世爾科技有限公司),配備 SRD3600 六通道真空脫氣機, DGP3600 RS 雙梯度快速分析型色譜泵(兩個*一致,同時又相互獨立的三元泵,通過 Chromeleon 軟 件一體化控制),WPS3000TSL 自動進樣器,TCC鄄3000 柱溫箱(配有兩個六通閥),Chromeleon 6. 8 變色龍 色譜管理軟件。 質譜系統:TSQ Vantage 三重四極桿質譜系統,配有 Xcalibur 數據處理系統(美國賽默飛 世爾科技有限公司),離子源:HESI。 赤霉素(GA3)、吲哚乙酸( IAA)、玉米素( ZT) 和脫落酸(ABA) 標準品(美國 Sigma鄄aldrich 有限公 司); 乙腈、甲醇 (Optima 級,美國 Fisher 公司),去離子水(18. 2 M贅 cm,Thermo 純水機制備)。 植株樣 品采自于黑龍江八一農墾大學作物實驗基地(黑龍江省大慶市林甸縣),檢測樣品采用液氮冷凍后,用 超低溫冰箱保存。 2. 2 樣品處理 大豆檢測樣品(葉片、莢皮、籽粒)冷凍貯存于-80 益冰箱中。 取 1 g 樣品,于液氮中研磨成粉末,轉 入 6 mL 預 冷 的 80% 甲 醇 ( 含 1 mmol / L BHT ), 于 4 益 下 避 光 浸 提 12 h, 于 4 益 下, 以 4000 r/ min 離心 15 min, 分離上清液,沉淀物中加 2 mL 預冷的 80% 甲醇,再于 4 益下浸提 2 h,離心,合 并上清液,定容至 10 mL,用去離子水 1頤 1 稀釋,過 0. 22 滋m 濾膜后,待測。 2. 3 在線固相萃取和色譜分離條件 SPE Column:Thermo Hypersep Retain AX 柱(20 mm伊3. 0 mm, 3 滋m), 左泵(Online SPE Pump),流 動相:甲醇(A)鄄水(B)。 分析柱:Thermo Acclaim PA2 色譜柱(150 mm伊2. 1 mm, 3 滋m),右泵 (Analyti鄄 cal Pump),流動相:甲醇(A)鄄0. 1% FA(B);柱溫:35 益 ,進樣量:10 滋L,六通閥切換程序及梯度淋洗條 件見表 1,Online SPE 流路見圖 1。
Auto tune 模式: 將 1 mg / L 標準液通過蠕動泵連續進樣。 由 TSQ Tune 質譜參數優化軟件自動獲得 的子離子碰撞能量及透鏡電壓等,相應離子對與文獻[11,12]相同,如圖 2 所示。 選擇反應監測(SRM):針對二級質譜或多級質譜的某兩級之間,即母離子選一個離子,碰撞后,從 形成的子離子中也只選一個離子。 因為兩次都只選單離子,所以噪音和干擾被排除得更多,靈敏度和信 噪比會更高,尤其對于復雜的、基質背景高的樣品(見圖)。 質譜條件:吲哚乙酸(IAA)、玉米素(ZT)采用正離子掃描方式、赤霉素(GA3 )和脫落酸(ABA)采用 負離子掃描方式,同時正負切換。 霧化溫度:350 益 ,鞘氣 30 arb,輔助氣:10 arb,Collision Gas Pressure:1. 5 mTorr,離子傳輸管溫度 270 益 ,質譜掃描參數: 掃描方式: SRM, 掃描循環時間: 0. 8 s, 分辨率: Q1, Q3 分辨率均設置為 0. 4 FWHM。 具體的加熱電噴霧電離(HESI) 模式掃描條件件見表 2。
3 結果與討論 3. 1 SPE 柱的選擇 SPE 的分離保留機理有反相、正相、離子交換、體積排阻、免疫親和等,GA3 、ABA、IAA 的 pKa分別為 第 12 期 賈鵬禹等: 在線固相萃取鄄高效液相色譜鄄串聯質譜法同時檢測大豆不同部位的 4 種植物激素 1745 4. 2,4. 5,4. 7,為酸性化合物; ZT 的 pKa = 11. 4,為堿性化合物。 現有的 SPE 方法多數只同時分析酸 性[11]或者堿性的植物激素[12] ,這樣只能得到片面的結果。 或者采用兩次不同的 SPE (MAX、MCX)方 式分別純化酸性或堿性植物激素,后合并凈化后的樣品[13] ,其涉及的前處理過程十分復雜,影響重現 性等。 本方法對 SPE 柱類型、上樣流速、pH 值、有機試劑等影響在線分析的主要因素進行了分析。 選擇 TurboFlow MCX,TurboFlow MAX,AG19,Retain CX,Retain AX 進行比較。 其中,TurboFlow 系列 柱需要運用體積排阻、離子交換、反相保留的機理,上樣速度一般要求 2 mL / min,以形成渦流,但在對 4 種植物激素的保留過程中, 始終無法同時保留,尤其是 GA3 在 TurboFlow 柱上始終在死時間直接被洗 脫下來。 AG19 是一種運用在離子色譜上的陰離子交換保護柱,對酸性化合物有較好的保留性能,但對 上樣溶劑的 pH 值有一定的要求,只能用中性流動相上樣,否則難以保留,這就與 MCX 的上樣條件相沖 突。 考慮到通過在 Retain AX 是一種高純度,高滲透的苯乙烯二乙烯基聚合物,通過鍵合季氨基增加對 酸性化合物(GA3 , ABA, IAA)的保留,同時具有一定的反相保留性能,可保留堿性化合物 ZT。 流動相的選擇對在線固相萃取具有顯著影響,甲醇、乙腈是反相色譜中常用的有機試劑,本方法選 擇流動相主要是考慮其對分析物的保留與基質的分離和在質譜中離子響應的高低。 在選定 Retain AX 柱作為 SPE 柱后,當用乙腈作為流動相時,堿性的 ZT 在 Retain AX 柱上的保留性能明顯下降,在死時間 直接被洗脫下來,無法與基質分離;但選擇甲醇作為上樣流動相時,這種情況就可以避免,推斷 ZT 在 Retain AX 上的保留主要是依靠反相色譜原理,與其在反相色譜中的保留性能有明顯的相關性。 本方法 同時采集正負離子信號,不宜添加過多的酸堿離子添加劑。 在相同條件下,采用甲醇作為分析流動相 時,植物激素的響應值明顯優于乙腈。 綜合以上因素,本方法選擇甲醇鄄水作為分析流動相。
4 結 論 本實驗建立了雙三元液相色譜串聯質譜 測定大豆不同部位的內源激素在線固相萃取 液質聯用分析方法。 在滿足常規分析的同時, 針對本實驗中遇到的基質干擾大、樣品前處理 復雜、重現性差、目標分析物含量低等問題 通過 Online SPE 技術在線除雜富集解決,有較多成熟的應用[15,16] 。 通過與已發表的關于植物激素研究的文獻比較[11,12] ,本方法的檢測限有明顯優勢,通過選擇合適 的 SPE 柱,保證不同性質的植物激素可以同時保留,與基質分離,一次進樣同時檢測酸堿性植物激素, 第 12 期 賈鵬禹等: 在線固相萃取鄄高效液相色譜鄄串聯質譜法同時檢測大豆不同部位的 4 種植物激素 1747 檢測結果更加全面,提高了檢測效率。 文獻[17]采用 HPLC 方法分析大豆中的植物激素, GA3 檢出限 為 0. 5 滋g / g,樣品未檢出,ABA 含量明顯高于其它成分。 本實驗結果與文獻[17]相符。 本方法樣品前 處理簡單方便,靈敏度高,固相萃取在線分析技術是一種高通量,快速的植物內源激素檢測技術,檢出限 *能滿足農業科學研究需要。 被測組分提取、濃縮、分離的在線進行,不僅省時而且改善了檢出限;而 且具有抗化學干擾、可靠性好的優點,特別適用于復雜基質中低含量組分的檢出。 本方法將有望廣泛地 應用于農業科學領域生理生化指標中被測物的高靈敏度、高準確度檢測。
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