豬IX型膠原α3 (COL9α3) ELISA 試劑盒 

實(shí)驗(yàn)原理

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一種基于抗原抗體反應(yīng)的免疫學(xué)檢測(cè)方法。其基本原理是利用抗原抗體的特異性結(jié)合，通過(guò)酶對(duì)底物反應(yīng)的顯色反應(yīng)，對(duì)樣本中的待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行定量或定性分析。ELISA方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、適用范圍廣等特點(diǎn)，因此在生物醫(yī)學(xué)研究、臨床診斷和食品安全檢測(cè)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。

豬IX型膠原α3 (COL9α3) ELISA 試劑盒

樣品收集、處理及保存方法

1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000 轉(zhuǎn)離心 10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心 30 分鐘取上清。

3. 細(xì)胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心 10 分鐘去除顆粒和聚合物。

4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心 10 分鐘取上清。

5. 保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解 凍并確保樣品均勻地充分解凍。

標(biāo)本的稀釋原則：

首先通過(guò)文獻(xiàn)檢索的方式了解待測(cè)樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，檢測(cè)的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的過(guò)程中，應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。計(jì)算濃度時(shí)，稀釋了“N"倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N"。 

標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：

2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為300 pg/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋300 pg/ml，150 pg/ml，75 pg/ml，37.5 pg/ml，18.5 pg/ml，9 pg/ml，4.5 pg/ml，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制。 如配制150 pg/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml（不要少于0.5ml）300 pg/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。 

生物su標(biāo)記抗體的稀釋原則：

臨用前以生物su標(biāo)記抗體稀釋液稀釋?zhuān)♂屒案鶕?jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100μl），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl生物su標(biāo)記抗體加990μl生物su標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。 

辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則：

臨用前以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋?zhuān)♂屒案鶕?jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100μl），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素加990μl辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 抗原包被：將抗原溶液加入到酶標(biāo)板孔中，包被抗原，使其在孔底形成一層薄膜。

2. 清洗：清洗酶標(biāo)板，去除未結(jié)合的抗原和其他雜質(zhì)。

3. 阻斷：加入阻斷液，封閉酶標(biāo)板孔中的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，以減少非特異性結(jié)合。

4. 清洗：清洗酶標(biāo)板，去除未結(jié)合的阻斷液和其他雜質(zhì)。

5. 加樣：加入待測(cè)樣本，使其與抗原發(fā)生特異性結(jié)合。

6. 清洗：清洗酶標(biāo)板，去除未結(jié)合的樣本和其他雜質(zhì)。

7. 加酶標(biāo)抗體：加入酶標(biāo)記的抗體，使其與特異性結(jié)合的樣本中的待測(cè)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。

8. 清洗：清洗酶標(biāo)板，去除未結(jié)合的酶標(biāo)抗體和其他雜質(zhì)。

9. 顯色反應(yīng)：加入底物溶液，發(fā)生酶催化反應(yīng)，產(chǎn)生有色產(chǎn)物。

10. 終止反應(yīng)：加入終止液，停止酶催化反應(yīng)。

11. 檢測(cè)：用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的光密度值，記錄數(shù)據(jù)。

ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的計(jì)算處理方法

1、擬和曲線：

輸入第一行： 濃度值， 如0 10 50 100 400

輸入第二行：該濃度下的調(diào)整后的od值，如0 0.586 1.397 1.997 3.42

選擇這些輸入的數(shù)據(jù)，用插入里的圖表按鈕，進(jìn)入圖表向?qū)В凇皹?biāo)準(zhǔn)類(lèi)型"中選擇“xy散點(diǎn)圖";在“子圖表類(lèi)型"中選擇“折線散點(diǎn)圖"，按“下一步";選擇“系列產(chǎn)生在行"，按“下一步";數(shù)據(jù)標(biāo)志，可以填寫(xiě)：如數(shù)據(jù)y軸，OD值;數(shù)據(jù)x軸，濃度;按下一步，點(diǎn)擊完成。可得曲線圖。

單擊曲線，按右鍵，選擇“添加趨勢(shì)線"，在類(lèi)型中，選擇多項(xiàng)式;在選項(xiàng)中，選擇顯示公式，選擇顯示R平方值。

得到公式和R平方值。

也可以用上面說(shuō)的方法： 雙擊圖表，把它輸入到圖表的數(shù)據(jù)中，就可以擬和曲線。

2、計(jì)算濃度：

第一次實(shí)驗(yàn)：

標(biāo)準(zhǔn)曲線為：

y = -4E-05x2 + 0.026x

R2 = 0.9745

為例，已知OD值，計(jì)算濃度。

由于y = -4E-05x2 + 0.026x，可以得到：

4E-05x2 -0.026x +y=0

ax2 +bx +y=0

注意事項(xiàng)

1. 試劑盒保存于2-8℃，切勿反復(fù)凍融或長(zhǎng)時(shí)間保存于室溫。

2. 實(shí)驗(yàn)前確保所有試劑均已恢復(fù)至室溫。

3. 加樣時(shí)注意避免產(chǎn)生氣泡。

4. 洗滌時(shí)要保證充分洗滌，避免殘留物影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5. 底物溶液應(yīng)避光保存，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中。

6. 酶標(biāo)儀應(yīng)使用450nm波長(zhǎng)進(jìn)行讀數(shù)，其他波長(zhǎng)可能導(dǎo)致誤差。

7. 本試劑盒僅用于科研實(shí)驗(yàn)和診斷參考，不適用于臨床診斷和治療。

試劑盒 必知說(shuō)明：

1）只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測(cè)效果，

2）不能混用其他制造商的產(chǎn)品，只有嚴(yán)格遵守本試劑盒的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明才會(huì)得到好的檢測(cè)結(jié)果。

3）由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對(duì)所有供貨商提供的所有原料進(jìn)行全面的鑒定與分析，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。

4）實(shí)驗(yàn)結(jié)果與試劑盒的有效性、實(shí)驗(yàn)者的相關(guān)操作以及當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān)。

5）請(qǐng)務(wù)必準(zhǔn)備充足的標(biāo)本備份。

6）不同批次的同一產(chǎn)品可能會(huì)有少許差別，

如：檢測(cè)限、靈敏度以及顯色時(shí)間等，請(qǐng)依據(jù)試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，網(wǎng)站電子版說(shuō)明書(shū)僅作參考。

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