線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ/NADH-輔酶Q還原酶測試盒

正式測定前務必取 2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義

復合體Ⅰ(EC 1.6.5. 3)又稱 NADH-CoQ還原酶或 NADH脫氫酶,廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞的線粒體中,是線粒體內膜中***蛋白復合物。該酶催化一對電子從 NADH傳遞給 CoQ,同時可使 O₂還原生成 O₂-,是呼吸電子傳遞鏈上產生 O₂-的主要部位。測定該酶活性,不僅可以反映呼吸電子傳遞鏈(ETC)狀態,而且可以反映活性氧(ROS)生成狀態。

測定原理

復合體Ⅰ能夠催化 NADH脫氫生成 NAD+,在 340nm下測定 NADH的氧化速率計算出該酶活性的大小。需自備的儀器和用品紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制

試劑一:液體 100ml×1瓶,-20℃保存;

試劑二:液體 20ml×1瓶,-20℃保存;

試劑三:液體 1.5ml×1瓶,-20℃保存;

試劑四:液體 25ml×1瓶,-20℃保存;

試劑五:液體 1ml×1支,-20℃保存;

試劑六:粉劑×1支,-20℃保存,用時加入 2ml蒸餾水;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。

工作液的配制:臨用前將試劑五轉移到試劑四中混合溶解;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。

樣本的前處理:

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

①準確稱取 0.1g組織或收集 500萬細胞,加入 1ml試劑一和 10uL試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

②將勻漿 600g,4℃離心 5min。

③棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心 10min。

④上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測定從線粒體泄漏的復合體Ⅰ(此步可選做)。

⑤步驟④中的沉淀即為線粒體,加入 200uL試劑二和 2uL試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10秒,重復 30次),用于復合體Ⅰ酶活性測定。、

測定步驟:

1、分光光度計或酶標儀預熱 30min以上,調節波長至 340nm,蒸餾水調零。

2、樣本測定

(1)工作液于 37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)孵育 5min。

(2)在微量石英比色皿或 96孔板中加入 10μL樣本、200μL工作液和 15μL試劑六,混勻,記錄 340nm處初始吸光值 A₁和 2min后的吸光值 A₂,計算 ΔA=A₁-A₂。

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復合體Ⅰ活力單位的計算

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下:

(1)按蛋白濃度計算

單位的定義:每 mg組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

復合體Ⅰ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr)÷T=1808×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

(2)按樣本鮮重計算

單位的定義:每 g組織每分鐘消耗 1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

復合體 Ⅰ活力 ( nmol/min/g鮮重 ) =[ΔA×V反總÷ ( ε×d )×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=365×ΔA÷W

(3)按細菌或細胞密度計算

單位的定義:每 1萬個細菌或細胞每分鐘消耗 1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

復合體Ⅰ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.73×ΔA

V反總:反應體系總體積,2.25×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數,6.22×103 L/ mol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 ml;V樣總:加入提取液體積,0.202 ml; T:反應時間,2 min;W:樣本質量,g;500:細胞或細菌總數,500萬。

b.使用 96孔板測定的計算公式如下:

(1)按蛋白濃度計算

單位的定義:每 mg組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

復合體Ⅰ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr)÷T=3616×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

(2)按樣本鮮重計算

單位的定義:每 g組織每分鐘消耗 1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。復合體 Ⅰ活力 ( nmol/min/g鮮重 ) =[ΔA×V反總÷ ( ε×d ) ×109]÷(W×  V樣÷V樣總 )

÷T=730×ΔA÷W

(3)按細菌或細胞密度計算

單位的定義:每 1萬個細菌或細胞每分鐘消耗 1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

復合體Ⅰ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=1.46×ΔA

V反總:反應體系總體積,2.25×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數,6.22×103 L/ mol/cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 ml;V樣總:加入提取液體積,0.202 ml;T:反應時間,2 min;W:樣本質量,g;500:細胞或細菌總數,500萬。

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