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基因測(cè)序儀的工作原理
閱讀：210 發(fā)布時(shí)間：2024-1-31
基因測(cè)序儀又稱DNA測(cè)序儀，是測(cè)定DNA片段的堿基順序、種類和定量的儀器。主要應(yīng)用在人類基因組測(cè)序、人類遺傳病、傳染病和癌癥的基因診斷、法醫(yī)的親子鑒定和個(gè)體識(shí)別、生物工程藥物的篩選、動(dòng)植物雜交育種等方面。
工作原理：
目前DNA測(cè)序儀的工作原理主要基于Sanger發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法或Maxam-Gilbert發(fā)明的化學(xué)降解法。這兩種方法在原理上雖然不同，但都是根據(jù)在某一固定的位點(diǎn)開(kāi)始核苷酸鏈的延伸，隨機(jī)在某一個(gè)特定的堿基處終止，產(chǎn)生以A、T、C、G為末端的四組不同長(zhǎng)度的一系列核苷酸鏈，在變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳進(jìn)行片段的分離和檢測(cè)，從而獲得DNA序列。由于雙脫氧鏈末端終止法更簡(jiǎn)便和更適合于光學(xué)自動(dòng)探測(cè)，因此在單純以測(cè)定DNA序列為目的的全自動(dòng)DNA測(cè)序儀中應(yīng)用廣泛。而化學(xué)降解法在研究DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)-DNA相互作用中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。這里主要介紹雙脫氧鏈末端終止法的測(cè)序原理[1]。
雙脫氧鏈末端終止法測(cè)序是利用DNA的體外合成過(guò)程-聚合酶鏈反應(yīng)，在DNA聚合酶的催化作用下，以目的DNA為模板，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，在引物的引導(dǎo)下完成。
普通的PCR反應(yīng)體系中，加入的核苷酸單體為4種2′-脫氧核苷三磷酸(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)。測(cè)序反應(yīng)體系中，加入的核苷酸單體為2',3雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。與dNTP相比，ddNTP在脫氧核糖的位置上缺少個(gè)羥基，反應(yīng)過(guò)程中雖然可以在DNA聚合酶作用下，通過(guò)其磷酸基團(tuán)與正在延伸的DNA鏈的末端脫氧核糖-OH發(fā)生反應(yīng)，形成磷酸二酯鍵而摻入到DNA鏈中，但它們本身沒(méi)有-OH，不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，從而使正在延伸的DNA鏈在此終止。
根據(jù)這一原理分別設(shè)計(jì)四個(gè)反應(yīng)體系，每一反應(yīng)體系中存在相同的DNA模板、引物、四種dNTP和一種ddNTP(如ddATP)，則新合成的DNA鏈在可能摻入正常dNTP的位置都有可能摻入ddNTP，導(dǎo)致新合成鏈在不同的位置終止。由于存在ddNTP與dNTP的競(jìng)爭(zhēng)，生成的反應(yīng)產(chǎn)物是一系列長(zhǎng)度不同的多核苷酸片段。
將制得的四組混合物全部平行地點(diǎn)加在電泳板上進(jìn)行電泳，每組制品中的各個(gè)組分將按其鏈長(zhǎng)的不同得到分離，從而制得相應(yīng)的放射性自顯影圖譜。從所得圖譜即可直接讀得DNA的堿基序列。