瑞士步琦
冷凍干燥含酵母菌的微球應(yīng)用
冷凍干燥應(yīng)用
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益生菌是一種有益于人體健康的微生物，常被用于改善腸道菌群。微膠囊包埋技術(shù)可以幫助保護(hù)菌株，延長(zhǎng)其在體內(nèi)的存活時(shí)間，不易受外界環(huán)境的影響而失活。因此，在生產(chǎn)益生菌產(chǎn)品時(shí)，需要考慮選擇合適的微膠囊技術(shù)，以確保益生菌的穩(wěn)定性和活性。下面這篇應(yīng)用非常好的結(jié)合了微膠囊包埋和冷凍干燥技術(shù)，證明菌種經(jīng)過包埋干燥后仍具有生物活性，為發(fā)酵工藝和食品轉(zhuǎn)化等領(lǐng)域開辟新的可能性。
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介紹
冷凍干燥，也稱為凍干是一種非常通用的脫水方法，常用于保存微生物、食物或藥物，如蛋白質(zhì)類藥物。它將冷凍和干燥結(jié)合在一個(gè)特別的操作中，可以創(chuàng)造出高質(zhì)量的干燥終產(chǎn)品。
冷凍干燥通常用于保存微生物培養(yǎng)物，因?yàn)樗哂胁豢珊鲆暤膬?yōu)點(diǎn)：儲(chǔ)存的方便性和增加郵寄微生物的可能性。此外，制得的產(chǎn)品只需要少量維護(hù)，培養(yǎng)基在儲(chǔ)存過程中不會(huì)受到污染，微生物可以長(zhǎng)時(shí)間保持活力。
然而，冷凍干燥技術(shù)對(duì)微生物至關(guān)重要，因?yàn)樗鼘?duì)微生物的生存能力和生理狀態(tài)都有負(fù)面影響。根據(jù)方法和生物體的不同，微生物存活率也各有不同；然而，活力水平明顯低于液氮儲(chǔ)存 2。觀察到的活力下降主要是由于一些不良副作用引起的，例如細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成1、敏感蛋白的變性或在此過程中膜脂質(zhì)的物理狀態(tài)發(fā)生一些不可逆的變化 3,5。為了防止這種影響，通常在冷凍或冷凍干燥前使用脫脂牛奶、蔗糖、甘油、 DMSO 或海藻糖等作為凍干保護(hù)物質(zhì)1,3。
據(jù)報(bào)道，海藻糖在干燥、冷凍、滲透脅迫和熱休克等非常環(huán)境下對(duì)酵母和細(xì)菌具有保護(hù)作用。這些保護(hù)效果與膜的穩(wěn)定和酶活性的保存有關(guān)。關(guān)于海藻糖的保護(hù)作用，已經(jīng)報(bào)道了幾種假設(shè)。一些報(bào)道認(rèn)為它的作用是通過多個(gè)外部氫鍵取代參與維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的水分子，另一些報(bào)道認(rèn)為它形成玻璃態(tài)結(jié)構(gòu)以確保物理穩(wěn)定性。
除了發(fā)酵過程或食品轉(zhuǎn)化，釀酒酵母或乳酸菌等微生物在益生菌膳食食品和飼料補(bǔ)充劑領(lǐng)域具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。然而，這些應(yīng)用需要在儲(chǔ)存過程中保持細(xì)胞活力。通過造粒和冷凍干燥技術(shù)相結(jié)合，可以得到大小和組成均勻的無塵顆粒。由于具有更高的顆粒表面積，這使得產(chǎn)品將具有良好的顆粒流動(dòng)性，更容易掌握的劑量和更快的產(chǎn)品復(fù)原性。盡管存在上述挑戰(zhàn)，冷凍干燥仍然是一種酵母、孢子真菌和細(xì)菌的方便保存方法，因?yàn)樗鼈兊?span style="color: rgb(86, 172, 221); box-sizing: border-box;">長(zhǎng)期生存能力通常保持得相當(dāng)好，而且菌株的儲(chǔ)存和分發(fā)要求也很簡(jiǎn)單。
因此，本應(yīng)用旨在生產(chǎn)釀酒酵母顆粒作為模型微生物，使用微膠囊造粒儀 Encapsulator B-390 作為造粒機(jī)，將酵母懸浮液擠壓進(jìn)入液氮中形成單分散球體，然后使用冷凍干燥機(jī) Lyovapor™ L – 200 進(jìn)行冷凍干燥處理。
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儀器，試劑和器材
儀器：
ESCO NordicSafe, Biosafety Cabinet Class II
BUCHI 微膠囊造粒儀 Encapsulator B-390
BUCHI 冷凍干燥機(jī) LyovaporTM L-200 Pro，干燥腔體搭配可加熱擱板
BUCHI LyovaporTM Software
試劑：
YPD 培養(yǎng)基, Sigma Aldrich
海藻糖, Sigma Aldrich
脫脂奶粉
瓊脂
去離子水
液氮
器材：
玻璃培養(yǎng)皿
液氮杜瓦瓶
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實(shí)驗(yàn)
本應(yīng)用中描述的工作是在無菌條件下進(jìn)行的。將 84g 市售面包酵母懸浮溶解在 50mL 無菌 YPD 培養(yǎng)基(Sigma Aldrich)中。在酵母懸浮液中加入 50mL 無菌凍干保護(hù)劑培養(yǎng)基（5g 海藻糖(Sigma Aldrich)和 5g 脫脂牛奶溶于去離子水中），然后用微膠囊造粒儀 B-390 進(jìn)行制粒(表1)。將擠壓后的液滴收集在液氮浴中冷凍，然后轉(zhuǎn)移到不銹鋼托盤中，保存在 -25°C 的冰箱中進(jìn)行冷凍干燥。
表1：微膠囊包埋參數(shù)
300μm 噴嘴 | 1mm 噴嘴 | |
頻率[Hz] | 680 | 60 |
電壓[V] | 750 | 2500 |
壓力[mbar] | 500 | 500 |
冷凍干燥步驟(初級(jí)干燥和次級(jí)干燥)使用 LyovaporTM 編程軟件，如表 2 所示。使用 LyovaporTM L-200 Pro 干燥腔體、可加熱的擱板和環(huán)境空氣。
表2：初級(jí)干燥和次級(jí)干燥凍干參數(shù)
無酵母菌微球采用與含酵母菌微球相同成分培養(yǎng)基和參數(shù)進(jìn)行制備。
冷凍干燥后，將 1mL 無菌水加入 1mL 微球中，用以復(fù)原樣品。對(duì)于含有酵母菌的菌珠，對(duì)每個(gè)重組溶液進(jìn)行10倍、100 倍和 1000 倍的連續(xù)稀釋。將復(fù)原后的溶液和稀釋液分別涂于 YPD 瓊脂平板上，如圖 1 所示。瓊脂板在 28℃ 培養(yǎng) 24h，評(píng)價(jià)細(xì)胞活力。
▲ 圖1：瓊脂平板上的酵母活力測(cè)試
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結(jié)果與討論
含有酵母的微球可以通過使用微膠囊造粒儀 B-390 進(jìn)行包埋制備，結(jié)果表明:用微膠囊造粒儀 B-390 將酵母滴入液氮中，可使酵母迅速顆粒化；用 300μm 的噴嘴和 1mm 的噴嘴分別制備了 700μm 和 1500μm 左右的微球。僅使用含凍干保護(hù)劑介質(zhì)的溶液也得到了類似的結(jié)果。如圖 2 所示，凍干后的微球在形狀和大小上與濕凍微球保持相似。
▲ 圖2：用微膠囊造粒儀 B-390 制得的 300μm 酵母微球，在凍干前（左）后（右）的對(duì)比
通過掃描電鏡對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。在圖 3 中，可以觀察到含有酵母的球珠(下兩圖)和僅由凍干保護(hù)劑培養(yǎng)基制成的球珠（上兩圖）在形態(tài)上的差異。含有酵母菌的微球具有由 5μm 顆粒組成的粗糙結(jié)構(gòu)，可以認(rèn)為是微生物，而只含有凍干保護(hù)劑的微球具有更光滑的結(jié)構(gòu)。
▲ 圖3：含酵母菌的凍干微球（下）和不含酵母菌凍干微球（上）的結(jié)構(gòu)對(duì)比
當(dāng)冷凍干燥時(shí)，考慮到膜中脂質(zhì)物理狀態(tài)的變化或由于某些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，生物系統(tǒng)可能受到破壞3,9。為了驗(yàn)證酵母菌的活力，將酵母菌重新水合，稀釋，并在 28°C 的 YPD 瓊脂板上培養(yǎng) 24 小時(shí)。圖 4 證實(shí)了文獻(xiàn)報(bào)道的內(nèi)容，即便失去了部分活力，酵母在凍干后仍然可以生長(zhǎng)2,4,6,10。
▲ 圖4：在 28℃ 瓊脂板中培養(yǎng) 24 小時(shí)后的酵母菌活力
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結(jié)論
含有酵母菌的微粒可以很容易地用微膠囊造粒儀 B-390 進(jìn)行制備，并使用凍干機(jī) LyovaporTM L-200 進(jìn)行冷凍干燥處理。B-390 的噴嘴直徑分別為300 μm和1000 μm，制得的微粒直徑分別為 700μm 和 1500μm。冷凍干燥后，珠粒的大小和形狀沒有變化。該顆粒流動(dòng)性好，容易掌握使用劑量，且與水混合后溶解速度快。凍干后的微生物在貯藏過程中仍能保持良好的活力，并能在復(fù)水化后成功生長(zhǎng)。
在本應(yīng)用中，造粒包埋和冷凍干燥的結(jié)合顯示出了非常好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。它可以在發(fā)酵工藝和食品轉(zhuǎn)化等領(lǐng)域開辟新的可能性，有利于生產(chǎn)制備劑量易控制和重組的培養(yǎng)發(fā)酵劑；另外，在益生菌和食品補(bǔ)充劑領(lǐng)域中獲得無塵且可自由流動(dòng)的粉末，同時(shí)保證產(chǎn)品顆粒大小和組成的均勻度。
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參考文獻(xiàn)
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