買到了BrainBits小鼠游離皮質培養試劑盒后,該如何使用呢?
一、制劑(無菌罩室溫):
1. 將80µl臺普蘭藍(Sigma T8154)加入0.5ml試管中進行下面的步驟4。
2. 12ml NbActiv1™至室溫。
3. 將2ml分離的初級神經元管置于30℃水浴中加熱1分鐘。
二、細胞分散(無菌罩室溫):
1. 用硅化巴斯德移液管,將整個試管的內容物轉移到無菌15ml離心管中。
2. 旋轉1100rpm (200 x G), 1分鐘。丟棄上清,留下約50µl含有微球的THRYVE胚胎wanquan液。
3. 分散細胞顆粒(用手指或管輕彈管底部),重懸于1ml NbActiv1™中。
4. 將20µl細胞液加入含有80µl臺盼藍(1:5稀釋)的0.5ml試管中。
5. 使用血細胞計(計算細胞/ml)或使用當前的實驗室程序計數細胞。
三、細胞電鍍(無菌罩室溫):
1. 用NbActiv1™稀釋0.2ml/cm2的細胞,用16000個細胞/cm2或所需濃度的平板。
2. 37℃,5% CO2, 9% O2, 95%濕度(或環境O2)孵育。
3. 4天后,神經元顯示軸突和樹突;突觸和動作電位開始于7天。
4. 每3-4天用新鮮的37℃CO2平衡NbActiv1™更換一半的培養基。
四、細胞鍍96孔板:
1. 用NbActiv1™以0.2ml/cm2稀釋細胞,并以10,000個細胞/孔(SD)和35,000個細胞/孔(C57/BL6)或所需的濃度進行平板稀釋
濃度。
2. 將鋼板放在工作臺頂部(而不是在引擎蓋下),并將邊緣用薄膜包裹15-20分鐘,使其均勻沉降。
3. 除去副膜,37℃,5% CO2, 9% O2, 95%濕度(或環境O2)孵育。
4. 4天后,神經元顯示軸突和樹突;突觸和動作電位開始于7天。
5. 每3-4天用新鮮的37℃CO2平衡NbActiv1™更換一半的培養基。
五、可行性分析:
1. 用37℃HBSS (0.2ml/cm2底物)沖洗兩次。
2. 用15mg/ml雙醋酸熒光素的丙酮原液和4.6mg/ml碘化丙啶的水原液配制染料混合物。
將每種15µl稀釋到1.5ml HBSS中(1:100稀釋)。
3. 在步驟1中加入的0.2ml HBSS中加入20µl染料混合物(1:10稀釋)。
4. 約1分鐘后,使用適合熒光素熒光的藍色激勵(綠色細胞)計數活細胞。計數死細胞
綠色激發為碘化丙啶熒光(小紅核)。
5. 生存能力=(綠色細胞/單位面積)/(總細胞數/單位面積)或生存=綠色細胞/(綠色+紅色細胞)。
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