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如何在質粒中添加/克隆GST標簽

將GST標簽添加到目標蛋白的優(yōu)先方法是使用pGEX系列載體，它們有不同的蛋白質裂解位點，而這對于后續(xù)提到的去除GST標記方法尤其重要。圖4描述了我們推薦克隆方法的過程和步驟。

（1）pGEX載體都有一個包含多個限制性酶切位點的多克隆位點（MSC），這些位點因pGEX載體而異。如表2所述。此外，所有的pGEX載體均含有三個終止密碼子，覆蓋了MSC之后DNA菌株上所有的三個可能的閱讀框，以確保所表達的蛋白質本身并不包含終止密碼子。

圖4：在目標蛋白質上添加GST標簽的克隆過程概述

（2）下一步是得到一個目的基因/蛋白質的PCR產物，該產物在兩個方向上均帶有所選pGEX載體MCS中存在的限制性酶切位點。這些引物應滿足以下條件：1.  3-4 nts的懸臂（越長越有利于限制性酶切反應，建議3-4個）

2.  限制性位點

3.  20-25 nts的目標基因

以在eGFP上添加一個GST標簽為例

圖例 – 上游引物懸臂

限制性位點 -> 以BamHI為例

eGFP的前20 nts5'-GGG GGATCC ATGAAACATCACCATCACCA-3'

圖例 –下游引物懸臂

限制性位點 -> 以EcoRI為例，反向互補

eGFP的最后20 nts，反向互補

5'-GGG GGATTC TTTGTATAGTTCATCCATGC-3'

注意本文僅是介紹如何將GST標簽添加目的蛋白質上，其他方法如酵母或細菌的同源重組也可完成。

        表2: 不同的pGEX載體和其MCS內的限制性酶切位點從5'到3'端排序

GST標簽蛋白的純化是如何進行的？

GST標簽蛋白純化是一種親和層析法，它利用GST對還原谷胱甘肽（其天然底物）的高親和力，依據所優(yōu)選的純化方法將谷胱甘肽與瓊脂糖凝膠或磁珠結合而達到純化的目的。如圖5為GST-標簽親和微球的示意圖。不同供應商的GST標簽親和產品的實際純化方案是不同的，包括僅針對其自身特定的GST親和力珠進行優(yōu)化的不同緩沖液成分間的差異。因此，建議不要將一個供應商的GST標簽蛋白純化方案應用于其他供應商產品。

圖5：GST-標簽親和微球的示意圖。通過微球表面的柔性間隔物將谷胱甘肽三肽與微球相結合，也可用于與GST標簽蛋白的結合。

GST標記的蛋白質純化方案

圖6介紹了用GST親和磁珠進行蛋白質純化的過程，但這些核心步驟僅基于使用GST-標簽親和磁珠進行純化。

步驟1：加入細胞裂解液后細胞裂解，細胞的整個蛋白質組懸浮在裂解緩沖液內，但帶有GST標簽的蛋白未與其它蛋白質分離。

步驟2：在細胞裂解液中加入GST親和標簽的磁珠，加入的磁珠量應多于細胞裂解液中帶GST標簽目標蛋白的數量。

步驟3：旋轉管/燒瓶幾個小時，使谷胱甘肽磁珠與細胞裂解液內的所有GST標簽蛋白充分結合。

步驟4：由于GST標簽蛋白與谷胱甘肽磁珠的結合特異性，所以僅帶有GST標簽的目標蛋白會與磁珠結合，而不會與其它蛋白質結合。

步驟5：對細胞裂解液施加磁力，使GST標簽蛋白與谷胱甘肽珠結合，而不會含有其它蛋白質。

步驟6：去除未結合的細胞裂解液/蛋白質上清， 帶有GST標簽的目標蛋白現已被純化。

圖6：使用磁珠純化帶有GST標簽的目標蛋白的示例性工作流程概述。

為了驗證帶有GST標簽的目標蛋白是否純化成功，建議利用Western Blot（蛋白質印跡法）通過抗GST抗體檢測純化蛋白。蛋白質印跡法示例可在此查看。

如何去除GST標簽？

GST標簽有26千道爾頓（kDa），是目前最大的親和標簽之一。作為一個完整的蛋白質，它甚至會大于它所結合的一些蛋白質，因此，科研者就會擔憂，這種大小的蛋白質人工連接在另一個蛋白質上是否會干擾蛋白質的功能性。所以是否有可能在蛋白質純化后去除GST標簽，以確保它不會以任何方式阻礙純化了的蛋白質后續(xù)研究。pGEX載體系列的創(chuàng)建者已經考慮到了這個問題，所以在表2中也已經提到。按照“如何在質粒中添加/克隆GST標簽 "一章中描述的方式創(chuàng)建GST標簽融合蛋白后可以選擇在其后去除此GST標簽。在質粒的MCS的5'端添加一個特定的蛋白裂解位點，即使在純化后，N-末端的GST-標記也可以被裂解，這也可以作為純化過程中的一種洗脫方法，而不僅僅是在瓊脂糖樹脂和磁珠純化方案中提到的洗脫緩沖液。由于這種方法可能會有小概率使目標蛋白質包含對應的蛋白酶切位點，所以在pGEX載體中有三種不同的蛋白裂解位點可供選擇。

           表3：不同的pGEX載體及其包括的蛋白酶裂解位點。

GST標簽去除方案（示例）

注意：該方案描述了如何使用凝血酶裂解位點從自由洗脫的GST融合蛋白上裂解GST標簽。

                     表4：凝血酶裂解所需的試劑

步驟（常規(guī)情況）

1. 在洗脫液或純化柱中加入10個凝血酶裂解單位~10µl每毫克的GST融合蛋白

2. 輕輕混勻，將混合物在室溫（22℃）下孵育2-16小時。

3. 孵育后，加入1mM的PMSF或ABESF終止反應。

4. 通過SDS檢查結果。

5. 通過SDS色譜法直接分離裂解產物（如：排組層析法）。

如果已經找到了理想的裂解條件，則可以用線性的方式擴增程序。

提示：可培養(yǎng)足量的GST標簽蛋白，并可在SDS-Page凝膠上觀察到0.01至0.06單位和不同孵育時間（例如2h，4h，6h等）的凝血酶。按所述方法停止反應，并將試劑分裝，放置在-20℃保存。

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