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Nanodisc 在 GPCR 抗體研發(fā)中的應(yīng)用
一、GPCR簡介
GPCR（ Guanosine-binding Protein Coupled Receptor）中文名稱為G蛋白偶聯(lián)受體，是一種膜蛋白受體。GPCR作為細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中的重要蛋白，其共同點(diǎn)是其蛋白體結(jié)構(gòu)中都有七個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)。研究顯示GPCR參與了很多細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，當(dāng)膜外的配體作用于該受體時(shí)，該受體的膜內(nèi)部分與G蛋白發(fā)生結(jié)合，從而激活G蛋白。G蛋白可通過兩種途徑傳遞細(xì)胞外的信息：第一種方式是打開跨膜離子通道，讓外界的離子進(jìn)入；第二種方式是激活第二信使，如：cAMp、IP3/DAG等。簡單來講，GPCR能結(jié)合細(xì)胞周圍環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)并激活細(xì)胞內(nèi)的一系列信號(hào)通路，引起細(xì)胞狀態(tài)和功能的改變，同時(shí)參與多種生命活動(dòng)以及內(nèi)分泌與代謝等多種生理過程。從疾病方面來看，GPCR也與糖尿病、心臟病、腫瘤、免疫疾病等重要疾病的發(fā)生、發(fā)展及治療密切相關(guān)。
隨著科研和生物醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)展的不斷深入，GPCR的重要性也愈發(fā)顯現(xiàn)，為了表彰在這一領(lǐng)域的貢獻(xiàn)，2012年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了兩位美國科學(xué)家：羅伯特·萊夫科維茨（Robert J. Lefkowitz）和布萊恩·科比爾卡（Brian K. Kobilka），他們因“G蛋白偶聯(lián)受體"研究領(lǐng)域的杰出貢獻(xiàn)而獲獎(jiǎng)。從生物醫(yī)療領(lǐng)域的數(shù)據(jù)來看，大約40%的現(xiàn)代藥物都以GPCR作為靶點(diǎn)。而至少有三分之一的小分子藥物是GPCR的激活劑或者拮抗劑，在暢銷藥物排行中就有眾多藥物屬于GPCR相關(guān)藥物，比如：充血性心力衰竭藥物Coreg、高血壓藥物Cozaar、乳腺癌藥物Zoladex等，而還有更多這樣的候選藥物小分子在臨床研發(fā)中。
針對(duì)GPCR的分類，主流有兩種方法：一是A-F分類系統(tǒng)，面向所有生物體內(nèi)的GPCR蛋白；第二種是將GPCR蛋白被分為Glutamate、Rhodopsin、Adhesion、Secretin、Frizzled/TAS2這5類。按照第二種分類標(biāo)準(zhǔn)來看，Rhodopsin受體類是GPCR家族中大的一類，而其下還分為多種亞家族。而整個(gè)Rhodopsin家族包含各種重要受體，如組胺受體、多巴胺受體、內(nèi)皮素受體、催產(chǎn)素受體等。而其它類GPCR也包含眾多受體種類，如鈣敏感受體、甜味味覺受體等。
二、GPRC單抗藥物開發(fā)
現(xiàn)階段，作為開發(fā)藥物靶點(diǎn)的受體約370個(gè)，分布于Glutamate、Rhodopsin、Adhesion、Secretin、Frizzled/TAS2 五大家族內(nèi)。這些GPCR主要與生理代謝和疾病的形成有關(guān)，包括癌癥、炎癥、感染、代謝疾病等。藥物作用于GPCR靶點(diǎn)，其主要的作用是阻斷或激活胞外信號(hào)對(duì)靶點(diǎn)的激活，調(diào)控由靶點(diǎn)介導(dǎo)的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)以及阻斷病毒通過靶點(diǎn)侵入。作用于GPCR受體的藥物可以是小分子藥物或抗體類藥物，相對(duì)于小分子藥物，單克隆抗體藥物治療GPCR相關(guān)疾病擁有多方面優(yōu)勢(shì)。抗體在體內(nèi)的清除率更低，作用時(shí)間更長；并且在給定劑量下，抗體的血漿濃度的個(gè)體差異更小。另一方面在藥物開發(fā)方面，對(duì)于一些受體，小分子藥物通過高通量篩選階段的陽性率很低，成藥難度大。此外單抗藥物可以具有對(duì)受體更高的特異性以及避免一些小分子要會(huì)帶來的副作用，如小分子藥物可以穿過血腦屏障引起藥副作用。現(xiàn)針對(duì)GPCR受體，用于治療癌癥、炎癥和感染的很多抗體藥物已經(jīng)進(jìn)入臨床或上市，而更多的其它抗體藥物正在加緊研發(fā)的過程中。
三、GPCR靶點(diǎn)的抗體藥物研發(fā)中需要解決的抗體制備相關(guān)問題
現(xiàn)GPCR抗原主要形式有： GPCR全長蛋白、合成的GPCR胞外N端或loop區(qū)域、帶有膜蛋白的細(xì)胞膜碎片、過表達(dá)GPCR的細(xì)胞、帶有GPCR的脂質(zhì)體、帶有GPCR的類病毒顆粒等。各種方法各有特點(diǎn)，現(xiàn)就其存在的問題做一個(gè)簡單描述。
圖1.GPCR抗原主要形式（來源：參考文獻(xiàn)3）
全長GPCR作為抗原的優(yōu)勢(shì)在于比較純凈且相對(duì)接近天然構(gòu)象，但困難在于獲得了全長蛋白后其原包裹在細(xì)胞膜內(nèi)的疏水域也暴露在外，這樣容易篩到結(jié)合跨膜區(qū)的抗體。同時(shí)由于疏水域暴露在外，蛋白也容易發(fā)生聚集影響正確抗體的形成。對(duì)于合成胞外N端或loop區(qū)制作抗原的方法相對(duì)簡單，但它們可能無法模擬蛋白的全部天然構(gòu)象，表位容易遺漏和失真。帶有膜蛋白的細(xì)胞膜碎片和過表達(dá)GPCR的細(xì)胞由于目標(biāo)GPCR在整個(gè)膜上含量比例很低，因此會(huì)給篩選帶來很高的背景從而影響結(jié)果。脂質(zhì)體和類病毒顆粒作為GPCR蛋白的載體可以有效降低篩選背景，是現(xiàn)在效果較好的方法之一，但由于脂質(zhì)體的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致在在應(yīng)用時(shí)有無法忽視的局限。
篩選方法分為體內(nèi)免疫和展示篩選。其中體內(nèi)免疫法是常用和經(jīng)典的方法之一，通過用抗原免疫動(dòng)物，然后從動(dòng)物的脾臟中分離B細(xì)胞，制備雜交瘤，篩選單克隆抗體。而是否能更好的得到產(chǎn)生目標(biāo)抗體的B細(xì)胞，用與引起免疫反應(yīng)的抗原的穩(wěn)定性、單一性、期望產(chǎn)生抗體結(jié)合的位點(diǎn)是否外露、不期望產(chǎn)生抗體結(jié)合的部分是否被包裹都顯得尤為重要。
四、Nanodisc用于GPCR抗體的制備
Nanodiscs是由膜支架蛋白(membrane scaffold proteins, MSPs)和磷脂分子構(gòu)成的磷脂雙分子層類膜結(jié)構(gòu)。通過這種特殊的結(jié)構(gòu)，GPCR可以整合到Nanodiscs中，保持其生物學(xué)活性，為GPCG的研究提供了有力的技術(shù)支持。膜支架蛋白(MSPs)是載脂蛋白(apo) A-I的縮減版，它們包繞著脂質(zhì)雙分子層從而形成圓盤狀的結(jié)構(gòu)，即納米盤。其包含一個(gè)朝向內(nèi)部脂層的疏水面和朝外的親水面。這一結(jié)構(gòu)使得Nanodiscs在水溶液中具有很高的溶解度，同時(shí)具有非常高的穩(wěn)定性。通過Nanodisc包裹，純化后的GPCG在保持空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和活性的同時(shí)，也將不期望暴露的跨膜域如同在細(xì)胞膜內(nèi)一樣包埋在磷脂雙分子層內(nèi)部。
圖2：膜蛋白組裝到Nanodiscs的原理圖。綠色：膜支架蛋白（MSPs）；灰色：磷脂；橙色：膜蛋白(來源Cube Biotech)
五、Nanodisc包裹純化后的GPCR用于抗原制備有眾多優(yōu)勢(shì)
1、Nanodisc可以為GPCR提供一個(gè)類似細(xì)胞膜雙分子層的結(jié)構(gòu)，使其原有的結(jié)構(gòu)和功能可以被保護(hù)。同時(shí)跨膜區(qū)域和膜外區(qū)域也能和在細(xì)胞膜上一致，避免了直接使用純GPCR作為抗體會(huì)產(chǎn)生的結(jié)合跨膜區(qū)域的抗體形成的問題。同時(shí)，通過Nanodisc包裹的GPCR作為抗原也避免的直接使用細(xì)胞膜碎片作為抗體會(huì)引起高背景等問題，使后續(xù)篩選難度大大降低。
2、Nanodisc 包裹完整GPCR，不會(huì)有使用合成胞外N端或loop區(qū)制作抗原造成的表位容易遺漏和失真的問題。
3、Nanodisc通過膜支架蛋白固定磷脂，使其結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，從而避免了使用脂質(zhì)體包裹GPCR作為抗原的不穩(wěn)定和易破裂等問題。
4、為了針對(duì)不同的應(yīng)用要求，膜支架蛋白可以是人源化或鼠源化的，如此可以避免用鼠作為免疫動(dòng)物，人源化的膜支架蛋白會(huì)引起不必要的免疫反應(yīng)。
六、將膜蛋白組裝到Nanodiscs中的兩種方法
方法1：組裝溶解在去污劑中的膜蛋白
在去污劑存在條件下將GPCR純化，然后再添加MSPs和磷脂。含有膜蛋白的Nanodiscs能夠自發(fā)地組裝，在去除掉表面活性劑后可以通過凝膠過濾（排阻層析）等方式來純化。
方法2：Nanodiscs與無細(xì)胞表達(dá)體系相結(jié)合
另一個(gè)方法是，GPCR在無細(xì)胞表達(dá)體系中被表達(dá)，通過加入已經(jīng)和GPCR結(jié)合預(yù)先組裝的Nanodiscs，膜蛋白能通過無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出來。
圖3：膜蛋白與Nanodisc的兩種組裝機(jī)制(圖片來源Cube Biotech網(wǎng)站)
左圖：膜蛋白（橙色）溶解在去污劑（深灰色）中并與凍干的MSP（綠色）和磷脂（淺灰）混合。然后去除去污劑，形成蛋白-Nanodisc復(fù)合物。右圖：預(yù)組裝了MSP與磷脂的Nanodiscs加入到無細(xì)胞反應(yīng)液（cell-free expression systems）中，新生的GPCR能夠自發(fā)地組裝到Nanodiscs中。
GPCR作為藥物靶點(diǎn)在未來有著巨大的潛力，隨著單克隆抗體研發(fā)相關(guān)技術(shù)和產(chǎn)品的豐富，在可見的未來將會(huì)有越來越多針對(duì)各類疾病的優(yōu)秀藥物產(chǎn)品推向市場！
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