皖儀科技液相色譜對原料乳和乳制品中三聚氰胺的檢測
前言
“三聚氰胺"，一個原本拗口生僻的化學品名字，如今再提及時，仍會令國人談之色變。15年前，對中國乳業來說，“三聚氰胺"在如此大面積的“舞臺"上的無恥跳踉，幾乎是一次空前的災難。而對中國消費者來說，帶給我們最大的震撼是，一個高速發展、體量龐大的中國乳品工業，其安全基礎竟如此脆弱。此事件后，為進一步加強對原料乳、乳制品以及含乳制品的監管要求，國家質檢總局出臺了一系列國家標準法規文件，明確了三聚氰胺含量檢測為原料乳與乳制品檢測中的必檢項目。
本篇文章參考了《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》GB/T 22388-2008高效液相色譜法條件，采用皖儀科技高效液相色譜儀LC3200系列配置紫外檢測器進行檢測。實驗結果表明，三聚氰胺的線性良好，R值在0.999以上，三聚氰胺標準品色譜峰正常，理論塔板數在15000以上。三聚氰胺標準品重復進樣6次，定性RSD值為0.165%，定量RSD值為0.356%，重復性較好。儀器檢測限為0.0096μg/mL，定量限為0.032μg/mL。在回收率實驗中，液態奶中三聚氰胺加標濃度分別為0.8μg/mL、2μg/mL、4μg/mL，測定5次進行分析，相對標準偏差分別為1.09%、0.76%、0.88%，加標回收率分別為83.3%，88.8%，94.5%。說明了該方法配備皖儀科技LC3200系列儀器滿足三聚氰胺的檢測需求。
1 實驗方法
1.1 儀器配置
表1 高效液相色譜系統配置清單
1.2 實驗材料及輔助設備
甲醇：色譜純；
乙腈：色譜純；
氨水：含量 25%～28%；
三氯乙酸；
檸檬酸；
辛烷磺酸鈉：色譜純；
三聚氰胺標準品：CAS 108-78-01，純度大于99.0%；
定性濾紙；
微孔濾膜：0.22μm；
pH計；
超聲波清洗機；
固相萃取裝置；
氮氣吹干儀；
渦旋混合器。
1.3 測試條件
流動相：離子對試劑緩沖液：乙腈=88:12；
色譜柱：C18色譜柱，4.6×150mm；
柱溫：40℃；
流速：1.0 mL/min；
進樣量：20μL；
檢測波長：240nm。
1.4 溶液配制
1.4.1 甲醇水溶液
準確量取50mL甲醇和50mL水，混勻后備用。
1.4.2 三氯乙酸溶液（1%）
準確稱取10g 三氯乙酸于1L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻后備用。
1.4.3 氨化甲醇溶液（5%）
準確量取5mL氨水和95mL甲醇，混勻后備用。
1.4.4 離子對試劑緩沖液
準確稱取2.10g檸檬酸和2.16g辛烷磺酸鈉，加入約980mL水溶解，使用氨水調節pH至3.0后，定容至1L備用。
1.4.5 三聚氰胺標準儲備液
準確稱取100mg（精確到0.1mg）三聚氰胺標準品于100mL容量瓶中，用甲醇水溶液溶解并定容至刻度，配制成濃度為1mg/mL的標準儲備液，于4℃避光保存。
1.4.6 三聚氰胺工作溶液
用流動相將三聚氰胺標準儲備液逐級稀釋得到的濃度為0.8μg/mL、2μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL的標準工作液，濃度由低到高進樣檢測。
2 結果與討論
2.1 系統適用性
圖1 流動相色譜圖
圖2 三聚氰胺標準品色譜圖
表2 三聚氰胺標準品色譜參數
說明：由上述譜圖可見，三聚氰胺標準品色譜峰正常，保留時間為15.498 min，理論塔板數為15000以上。
2.2 標準曲線
圖3 三聚氰胺標準曲線及相關系數
說明：本次測試的三聚氰胺標準工作曲線濃度為0.2μg/mL、2μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL。三聚氰胺標準曲線線性范圍較好，線性相關系數R＞0.999，滿足實驗分析需求。
2.3 重復性
圖4 三聚氰胺標準品重復性實驗色譜圖
表3 三聚氰胺標準品色譜參數
說明：三聚氰胺標準品重復進樣6次，保留時間RSD值為0.165%，峰面積RSD值為0.356%，重復性較好。
2.4 檢出限
圖5 三聚氰胺標準品色譜圖
表4 三聚氰胺標準品色譜參數
說明：結果表明使用配備皖儀科技LC3200系列儀器檢測三聚氰胺標準品的檢測限為
0.0096μg/mL，定量限為0.032μg/mL。
2.5 加標回收驗證
2.5.1 提取
選擇液態奶作為基質，稱取2.03g試樣于50mL具塞塑料離心管中，加入15mL三氯乙酸溶液（1%）和5mL乙腈，超聲提取10min，在振蕩提取10min后，以不低于4000r/min離心10min。上清液經三氯乙酸溶液潤濕的濾紙過濾后，用三氯乙酸溶液定容至25mL，移取5mL 濾液，加入5mL水混勻后做待凈化液。
2.5.2 凈化
將待凈化液轉移至陽離子交換固相萃取柱（基質為苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，體積3mL,填料質量60mg）中。依次用3mL 水和3mL甲醇洗滌，抽至近干后，用6mL氨化甲醇溶液（5%）洗脫。整個固相萃取過程流速不超過1mL/min。洗脫液于50℃下用氮氣吹干，殘留物（相當于0.4g樣品）用1mL 流動相定容，渦旋混合1min，過微孔濾膜后，供HPLC測定。
2.5.3 加標回收
對液態奶進行低、中、高濃度加標重復測定，三聚氰胺加標濃度分別為0.8μg/mL、2μg/mL、4μg/mL，分別測定5次進行分析。
圖6 液態奶加標4μg/mL三聚氰胺標準溶液色譜圖
表5 液態奶加標三聚氰胺標準溶液色譜參數
說明：液態奶中三聚氰胺加標濃度分別為0.8μg/mL、2μg/mL、4μg/mL，測定5次進行分析，計算得三聚氰胺相對標準偏差分別為1.09%、0.76%、0.88%，加標回收率分別為83.3%，88.8%，94.5%，滿足《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》GB/T 22388-2008高效液相色譜法方法要求。
2.6 樣品測試
取液態奶進行測試，經提取、凈化操作后，經0.22μm的濾膜過濾。進樣量取20μL上樣分析，測試譜圖如下所示。
圖7 液態奶樣品色譜圖
說明：從檢測結果可知，液態奶樣品中未檢出三聚氰胺，結果正常。
2.7 注意事項
1. 三聚氰胺屬于2B類致癌物，在制備三聚氰胺相關溶液時需要注意佩戴好實驗室防護用品；
2. 在制備三聚氰胺標準儲備液時需用甲醇水溶液溶解并定容，配制過程中發現三聚氰胺標準品較難溶于甲醇水溶液中，需簡單超聲溶解后再進行定容，或50℃水浴加熱溶解后定容至刻度；
3. 三聚氰胺標準儲備液需在4℃避光保存，液相進樣小瓶可選擇棕色瓶。
3 結論
本次采用皖儀科技高效液相色譜儀LC3200系列配置紫外檢測器，依據《原料乳與乳制品中三聚氰胺的測定方法》GB/T 22388-2008 高效液相色譜法。實驗結果顯示，三聚氰胺的線性良好，R值在0.999以上，三聚氰胺標準品色譜峰正常，理論塔板數在15000以上。三聚氰胺標準品重復進樣6次，定性RSD值為0.165%，定量RSD值為0.356%，重復性較好。儀器檢測限為0.0096μg/mL，定量限為0.032μg/mL。在回收率實驗中，液態奶中三聚氰胺加標濃度分別為0.8μg/mL、2μg/mL、4μg/mL，測定5次進行分析，相對標準偏差分別為1.09%、0.76%、0.88%，加標回收率分別為83.3%，88.8%，94.5%。說明了該方法配備皖儀科技LC3200系列儀器滿足原料乳和乳制品中三聚氰胺的檢測需求。
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