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皖儀科技液相色譜手性氨基酸應(yīng)用專機(jī)系統(tǒng)

氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本組成單位，同時(shí)也直接參與許多生命活動(dòng)。在構(gòu)成人體蛋白質(zhì)的20種基本氨基酸中，除了甘氨酸外都具有手性，因此這些氨基酸都存在著L型和D型兩種手性同分異構(gòu)體。

生命體中D型氨基酸的含量水平和各種生命現(xiàn)象息息相關(guān)，可以反映諸如疾病的發(fā)生和進(jìn)程、細(xì)菌的感染和繁殖等。例如，血液中D-絲氨酸、D-脯氨酸和D-天冬氨酸的水平與腎功能密切相關(guān)，而D-天冬氨酸和D-脯氨酸的水平與糖尿病密切相關(guān)。

現(xiàn)代食品以及營(yíng)養(yǎng)學(xué)上對(duì)于氨基酸手性異構(gòu)體的分析也具有很大的意義。例如，牛奶中D-丙氨酸的濃度升高可以揭示微生物對(duì)牛奶的污染，葡萄酒和醋中的D-脯氨酸含量，則可被用于鑒定產(chǎn)品的發(fā)酵年份。

現(xiàn)有成熟的氨基酸檢測(cè)方法，包括茚三酮染色以及氨基酸分析儀等，都不涉及氨基酸手性異構(gòu)體的測(cè)定。氨基酸手性異構(gòu)體的分離檢測(cè)常用的方法有化學(xué)拆分法和物理拆分法。化學(xué)拆分法工藝較為成熟，多用于工業(yè)生產(chǎn)，但是產(chǎn)品的拆分率、產(chǎn)物光學(xué)純度都不高，污染和能耗也較大，不適用于樣品的精確檢測(cè)分析。

物理拆分法包括膜拆分、毛細(xì)管電泳拆分、色譜拆分等。其中膜拆分受制于膜的穩(wěn)定性和使用壽命，不適用于高通量快速檢測(cè)分析；毛細(xì)管電泳拆分盡管分辨率高，但是一次只能拆分一種或少數(shù)幾種氨基酸的手性異構(gòu)體，不適用于復(fù)雜實(shí)際樣品的分析檢測(cè)；色譜拆分法適用范圍較廣、靈敏度較高，能實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品中的氨基酸手性異構(gòu)體檢測(cè)分析。

但是色譜拆分氨基酸手性異構(gòu)體需要采用昂貴的手性色譜柱。并且由于大部分氨基酸在紫外光區(qū)沒有吸收和特征熒光，因此在常用的色譜紫外檢測(cè)器中的效果并不好。為了解決以上問題，通常對(duì)待檢測(cè)含手性氨基酸的樣品進(jìn)行色譜柱前衍生，以提高對(duì)手性氨基酸的檢測(cè)靈敏度和色譜分離度。本方法是一種簡(jiǎn)單、靈敏且可重復(fù)的自動(dòng)柱前衍生化對(duì)28種手性氨基酸分離的檢測(cè)方法。

1 方法原理

氨基酸手性衍生試劑可以分為羧基衍生試劑和胺基衍生試劑，這些衍生化試劑自身具有手性，在與待測(cè)的氨基酸樣品通過化學(xué)反應(yīng)結(jié)合后，使待測(cè)的氨基酸對(duì)映異構(gòu)體引入額外的手性中心，成為非對(duì)映異構(gòu)體，從而可以在非手性色譜柱中實(shí)現(xiàn)分離。在此方法中，使用鄰苯二甲醛 (OPA)與N-異丁酰基-L-半胱氨酸(IBLC)，與手性氨基酸反應(yīng)形成了熒光非對(duì)映異構(gòu)體。衍生過程中如圖1所示。

    圖1 衍生試劑與氨基酸反應(yīng)過程儀器配置及實(shí)驗(yàn)方法

· 儀器配置清單

· 試劑和標(biāo)準(zhǔn)品制備

· 標(biāo)準(zhǔn)品清單

· 試劑清單
單標(biāo)制備：稱取單標(biāo)適量，加0.1 mol HCL(用量筒量取4.1mL密度為1.19g/cm3質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37%的濃鹽酸倒入裝有適量的純水的燒杯中，轉(zhuǎn)移至500mL容量瓶中定容)溶解定容，再用水稀釋制成所需的濃度。

混標(biāo)制備：移取單標(biāo)儲(chǔ)備液加水稀釋制成混標(biāo)對(duì)照品溶液。硼酸溶液：硼酸鹽緩沖液（購(gòu)買的成品，ph10.2）。衍生溶液：稱取IBLC試劑約0.2486g、OPA試劑約0.1824g置5mL容量瓶中，加硼酸溶液溶解并定容至刻度，混勻即得。0.1%乙酸溶液：移取1mL乙酸加水溶解定容至1000mL，混勻即得。50mM乙酸鈉：準(zhǔn)確稱取4.101g無水乙酸鈉，用水定容至1000mL，用乙酸溶液調(diào)節(jié)pH7.0。

色譜條件如下圖所示:

進(jìn)樣器衍生程序：如下圖所示。注：A1、B1、C1、D1位置溶液分別為硼酸溶液、衍生溶液、0.1%乙酸溶液、標(biāo)樣。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

· 氨基酸線性圖與線性數(shù)據(jù)下圖各項(xiàng)數(shù)據(jù)可知，28種氨基酸線性良好，R值均在0.999以上，完全滿足各種實(shí)驗(yàn)分析需求。

· 分離度（氨基酸出峰位置譜圖與數(shù)據(jù)結(jié)果）

由上圖及上表中數(shù)據(jù)顯示，手性氨基酸峰型較好，分離度均在1.2以上，分離效果較好。

總結(jié)

本應(yīng)用介紹的分析方法，采用皖儀科技高效液相色譜儀LC3600系列配置熒光檢測(cè)器、具備在線衍生功能的針在流路進(jìn)樣器，使用OPA及IBLC衍生試劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：手性氨基酸線性良好，R值均在0.999以上，各個(gè)氨基酸峰型較好，分離度均在1.2以上，分離效果好。說明了該方法配備皖儀科技LC3600系列儀器檢測(cè)手性氨基酸的可行性。