流式細胞力學測試分析

流式細胞力學測試分析       細胞力學測試分析系統

德國Zellmechanik公司

AcCellerator型

單細胞力學流式分析系統

研發背景

1 研究細胞力學在臨床有什么意義？ 如何區分不同果實的成熟度？

解決方案：施加適當的力并感應水果的機械特性，將清楚地向您展示成熟和過熟的獼猴桃之間的區別。

這是否也適用于較小的水果組織碎片？如果我們下降到單細胞水平怎么辦？

細胞的機械特性由功能上重要的細胞成分控制，例如細胞骨架。它們構成了一種新興的無標記生物標志物，可以直接了解細胞功能或功能障礙。因此，機械特性有助于理解和評估藥物治療效果、免疫細胞活化、干細胞分化、癌癥預后或培養細胞的狀態和質量的評估。

   細胞變形能力與細胞的狀況和功能相關。

   無需標記即可評估細胞變形能力。

   應用潛力巨大。

細胞力學構成了研究從發育到疾病的主題的關鍵科學目標。

2 為什么采用單細胞流式分析？

Jochen Guck 教授在德累斯頓工業大學使用 AFM 和光學拉伸來揭示細胞力學與細胞功能（或功能障礙）之間的相關性。這些方法的一個主要障礙是低通量（多 100 個細胞/小時）。測量過程為：找到一個細胞，停止施力，整個實驗結束后釋放細胞，分析測量參數。為了克服耗時的步驟，于是他們開發了一種使用具有連續力和動態分析的連續流的方法：RT-DC。

Oliver Otto 博士和 Philipp Rosendahl 博士在 2013 年左右實施了這個想法。從那時起，已經發表了許多具有高影響力的科學論文，并且技術開始普及。

現在可以同時測量細胞的物理特性和熒光信號 (RT-FDC)，從而可以將細胞的物理特性與細胞生物學的黃金標準（熒光流式細胞術）進行比較和關聯。近還可以沿通道動態跟蹤細胞變形并研究變形的時間相關動力學 (dRT-DC)。

技術原理

1 如何高速的壓縮單個細胞？

為了產生確定的力，孤立的細胞被泵送通過橫截面略大于細胞橫截面的微通道。周圍流體的壓力梯度產生流動剖面并使細胞流體動力學變形。流體的流速和粘度控制作用在細胞上的力。

細胞可以通過流體動力變形。

力由流速和粘度控制。

較軟的細胞顯示較大的變形。

RT-DC 中的“實時"來自于拍攝圖像時對細胞輪廓的即時分析。

細胞面積、高度、寬度、縱橫比等的立即計算允許對數據進行即時觀察和選通。

該算法還計算細胞的亮度和亮度偏差等參數，從而深入了解形態學特性。

系統保存每個檢測到的事件圖像，可以輕松查看異常值是碎片還是您正在尋找的稀有細胞。

3 如何表征力進而計算楊氏模量？

骨髓生態位模擬物通過整合素信號調節 HSPC 功能

造血干細胞和祖細胞 (HSPC) 錨定在骨髓 (BM) 中稱為造血生態位的特殊微環境中。這些細胞由它們的自我更新能力和產生所有成熟血細胞的能力來定義。在臨床或組織工程使用之前，人類 HSPCs 可以通過表面抗原 CD34 進行富集。由于這些細胞在大多數移植來源中占少數，并且適用細胞的數量有限，因此已使用細胞因子雞尾酒或小分子建立離體擴增培養物. 然而， HSPCs 在懸浮液中的體外培養會導致異質細胞群具有未定義的細胞身份。

在 BM 生態位中，HSPCs 不僅由細胞因子維持，而且由細胞-基質粘附初步維持，通過粘附受體介導，例如整合素 (ITG)。在這方面，發現 β1 (CD29) 和 β2 ITGs 促進 HSPCs 與間充質基質細胞 (MSCs) 的初始接觸并且 β3 (CD61) 表達被證明是體內 長期再增殖 HSPCs 的標志物. 因此，使用 HSPC 和 MSC 等生態位細胞的共培養離體重塑 BM 生態位逐漸成為人們關注的焦點，并被證明是干細胞擴增的有前途的工具. 然而，在臨床或研究應用中，兩個細胞群的直接接觸需要 HSPC 培養后純化。

為了解決這些問題，我們使用了一種在體外重塑BM細胞外基質的新型培養方法，即從永生化間充質基質細胞（SCP-1）衍生的脫細胞細胞外基質（ECM）支架。這種支架被發現具有高度可重復性，并提供超過 500 種蛋白質，包括主要的生態位蛋白，如膠原蛋白、纖連蛋白、糖胺聚糖以及骨橋蛋白和信號分子，如基質衍生因子 1 (SDF-1)。因此，提供了存在于BM壁龕中的粘合面和物理提示。發現周圍環境的生物力學力通過整合素信號轉導至細胞，并在體外被證明可以控制 HSPC 的命運。 _ _ _ _ 這些物理方面被證明是分化的標志并驅動細胞命運決定。然而，HSPC 與 BM 基質相互作用的詳細機制僅關于細胞外環境的了解較少。

通過培養從粒細胞集落刺激因子 (G-CSF) 動員的健康供體的外周血 (PB) 中分離的人 CD34 +細胞，在去細胞 ECM 制劑上使用低濃度的細胞因子，我們可以分離兩種細胞部分：貼壁 (AT) 和上清液。 SN) 細胞，類似于與 MSC 的 HSPC 共培養物。使用實時變形細胞儀 (RT-DC)為了揭示塑料培養皿 (PCD) 中新鮮分離的 SN、AT 和經典懸浮培養的 HSPCs 的生物力學表型，我們發現新鮮分離的細胞與培養細胞相比是同質的可變形細胞和小細胞。與 PCD 培養或 SN 細胞相比，AT 細胞顯示肌動蛋白聚合到應力纖維、強烈的遷移行為和不易變形的表型。發現 SDF-1 通過 CXC 趨化因子受體 4 型 (CXCR4) 被 AT 細胞主動識別和內化。此外，CXCR4 被認為在 AT 細胞中偏向 ECM 蛋白。重要的是，我們發現在 AT 細胞上誘導 ITGαIIb、ITGαV 和 ITGβ3 的表面表達，并且可以證實 ITGαvβ3 在 HSPC-ECM 相互作用中在粘附和遷移方面的重要作用。

實時熒光和可變形細胞儀

細胞機械表征的吞吐量近已接近傳統流式細胞儀的吞吐量。然而，這種非常敏感、無標記的方法仍然缺乏分子標記的特異性。在這里，我們開發了一種將實時一維成像熒光和可變形細胞術結合在一個儀器 (RT-FDC) 中的方法，從而開辟了許多新的研究途徑。我們通過使用亞細胞熒光定位來識別有絲分裂細胞并在 RNA 干擾屏幕中測試這些細胞的機械變化來證明其實用性。

具有分子特異性的基于智能圖像的變形輔助細胞分選

盡管無標記細胞分選對于提供原始細胞以供進一步分析或使用是可取的，但目前的方法缺乏分子特異性和速度。在這里，我們將實時熒光和可變形細胞儀與基于駐表面聲波的分選相結合，并使用高效的深度神經網絡將分子特異性轉移到基于圖像的分選中。除了一般性能外，我們還通過從沒有標簽的全血中分選中性粒細胞來展示這種方法的實用性。

虛擬流體通道中的高通量細胞和球體力學

利用固有材料特性（即彈性和粘度）對細胞進行表型分析，越來越被認為在基礎和應用生命科學研究中具有重要意義。早期的發展主要由諸如原子力顯微鏡、微量吸管以及光學拉伸等技術推動，并專注于細胞骨架蛋白結構和粘彈性細胞特性之間的基本相互作用，從而將物理學和生物學結合在一個分子以及細胞規模. 在這一領域，已發現機械敏感性是細胞如何響應并與環境交流的基本機制。

機械表型研究細胞功能的巨大成功為轉化研究的應用鋪平了道路，但需要提高樣品通量，這是現有方法無法達到的。在微流體裝置中找到了應對這一挑戰的一個答案。早在幾十年前，Hochmuth 等人。利用玻璃毛細管和高速視頻顯微鏡來研究流動中的紅細胞變形. 在他們的開創性工作中，他們對紅細胞的形狀、方向和粘度進行了廣泛的表征。玻璃毛細管具有所有微流體系統的優點，即高通量和連續樣品處理能力，但缺乏設計和實施復雜流體流動的靈活性。

軟光刻技術作為一種快速成型技術的引入*改變了創建微流體結構的方式。使用彈性體的復制品使實驗室芯片設備的臺式生產能夠訪問納米和微米級的單分子和單細胞實驗。例如，Gossett 等人。展示了各種細胞系的高速機械表型分析，并展示了胚胎干細胞對其多能狀態的辨別能力，并具有足夠的統計能力. Dudani 等人擴展了在拉伸流中拉伸細胞的想法。朝向夾流幾何形狀，其中液壓回路設計用于在多種拉伸模式下變形細胞。近，機械細胞表征也得到了實時數據分析以及熒光標記的補充，以將固有材料特性的敏感性與分子標記的特異性結合起來。

雖然片上實驗室設備現在通常用于轉化研究以評估粘彈性特性，例如，用于研究傳染病的發病29和監測患者隨時間的狀態，但高通量分析這種無標記的生物標志物目前僅限于單細胞，不包括多細胞結構。然而，詳細了解力學如何影響組織發育和體內平衡將與建立將材料特性納入組織工程領域的 3D 細胞培養模型高度相關. 盡管使用原子力顯微鏡和微量吸管抽吸目前的方法在球體上進行了一些初步工作，但缺乏應用單一實驗方法同時對細胞和組織進行高通量表征的潛力。

用于球體高速機械表型分析的合適微流體系統是玻璃比色皿。這些比色皿的直徑為數百微米，是基于熒光的流式細胞儀中的主要實體，其中通過激光激發和檢測發射光和散射光來分析易位細胞36. 雖然為球體提供足夠的限制，但商業流式細胞儀無法通過其機械特性分析單個細胞。原因之一在于比色杯的大橫截面積，這是減少碎屑阻塞所必需的，但也會導致流體動力應力幅值低。由于彈性和粘度的測定先需要將細胞暴露在足夠的剪切力和法向應力下，其次需要檢測相應的細胞變形，因此大比色皿直徑有效地抑制了機械測量。

在這里，我們引入了虛擬流體通道，以在商用流式細胞儀的玻璃比色皿內創建可變橫截面的微流體收縮。虛擬通道是液體結合的微流體裝置，由低雷諾數下的共流水性聚合物溶液形成，其中穩定的護套將樣品流限制在不混溶的液相之間。我們證明了虛擬流體通道尺寸可以在幾秒鐘內實時調整，并能夠對細胞和球體的生物樣品進行高通量流變測量。

利用定義通道直徑的簡單比例定律，該定律取決于流速和粘度，但不取決于聚合物組成，我們研究了不同程度的虛擬限制中的懸浮細胞。與在泊肅葉流中發現的細胞相比，我們的結果揭示了類似于橢圓體的特征形狀。這種穩態可以通過源自液-液界面粘度失配的流體動力應力來解釋，我們展示了它在簡單的蠕變順應性實驗中的應用，該實驗允許提取材料特性。

我們開發了一個分析模型，并將界面應力與層流系統泊肅葉流內的典型剪切應力和正應力分布進行比較。我們的結果證實，嵌入在大幾何形狀內的虛擬通道中的小物體（例如比色皿中的單個細胞）的細胞變形受界面應力控制，而大物體（例如，作為玻璃比色皿中的組織模型系統的球體）主要由剪切變形壓力。

我們將我們的技術與實時可變形細胞儀 (RT-DC) 相結合，用于生物樣品的高通量表征。在原理驗證實驗中，我們表明虛擬通道可用于執行機械細胞測定和無標記識別細胞骨架改變。后，我們研究了單細胞力學對組織穩定性的作用。虛擬通道允許直接比較單個細胞和相應組織的流變特性。我們的結果表明，細胞的彈性模量比組織的彈性模量高出一個數量級，而組織的剛度隨著尺寸的增加而增加。

腫瘤細胞在轉移中的機械適應性

轉移之旅：應對壓力和外力

迄今為止，轉移性進展是癌癥致命的方面，繼發性腫瘤的發展占癌癥相關死亡總數的 90%（Steeg，2016 年）。導致這些致命二級病灶發展的過程遵循“轉移級聯"并包括不同的連續步驟。它始于健康細胞獲得突變和表觀遺傳修飾，導致健康組織中原始原發性實體瘤的不受控制的增殖和腫瘤生長（Grandér，1998 年；Vicente-Due?as 等人，2018 年）。這種初始增長伴隨著有利微環境的發展（Werb 和 Lu，2015)，特別是通過新形成的血液/淋巴管在腫瘤周圍的血管生成/淋巴管生成 ( Stacker 等人，2014 年；Watnick，2012 年)，炎癥樣免疫反應 ( Whiteside，2006 年)，以及周圍細胞外的重塑矩陣（ECM）（Alexander 和 Cukierman，2016 年）。同時，來自原發性腫瘤的一些腫瘤細胞獲得了新的特性，使它們能夠離開原發性腫瘤并侵入周圍的基質或沿著附近的血管移動（Gritsenko et al., 2017）。對局部實質的侵襲可以是主動的（細胞自主）和/或由原發性腫瘤中發生的間質液壓力驅動（由腫瘤內生長的細胞以及滲漏血管和淋巴管之間的壓力差異引起）。Piotrowski-Daspit 等人，2016 年；Stuelten 等人，2018 年）。腫瘤內淋巴管的發育有利于淋巴結轉移 ( Karaman and Detmar, 2014) 雖然不是致命的，但通常伴隨著轉移過程。然而，威脅生命的遠處轉移發生在血流內傳播時，通過直接進入血管內實現。有趣的是，近的研究表明，淋巴結轉移可以作為血液定植的平臺（Brown 等人，2018 年；Pereira 等人，2018 年）。免疫細胞可以幫助血管內滲入（Harney 等人，2015 年；Linde 等人，2018 年），并且可以作為單個細胞或侵襲性細胞的集體簇發生（Cheung 等人，2016 年））。當腫瘤細胞在血流中轉運時，它們被稱為循環腫瘤細胞 (CTC)。如果 CTC 設法逃脫免疫系統并在血流力和粘附力之間的拉鋸戰中幸存下來（Fan 等人，2016 年），它們終將停止并粘附在血管壁上（Osmani 等人，2019 年）?；蛘?，如果它們被困在小型毛細血管中，它們也可以獨立于粘附力而停止（Kienast 等人，2010 年）。在極少數情況下（特別是肺轉移），附著在內皮上的腫瘤細胞會增殖并形成血管內轉移（Al-Mehdi 等，2000）。然而，在大多數情況下，腫瘤細胞需要經歷外滲，這是停滯的腫瘤細胞退出血液循環的過程。已經描述了多種外滲機制，例如血細胞滲出 ( Strell and Entschladen, 2008 ) 和內皮重塑 ( Lapis et al., 1988 )。循環的這種退出終允許腫瘤細胞到達附近器官的基質/實質，如果新到達的器官的微環境適合它們，它們可以在那里增殖并形成轉移（Peinado et al., 2017）或保持休眠狀態狀態直到他們的環境演變并允許他們茁壯成長（Aguirre-Ghiso，2018 年；Nguyen 等人，2009 年）。

隨著腫瘤細胞通過所有這些步驟，它們面臨著各種變化的外部機械應力，挑戰它們的生存和進展，需要特定的機械性能。在腫瘤生長的早期階段，由于流體進入和排出間質空間的不平衡（Mohammadi 和 Sahai，2018 年）以及微環境推回腫瘤細胞，細胞會受到越來越高水平的壓縮應力（圖 1 ）。擴大腫瘤體積（Jain 等人，2014 年；Stylianopoulos 等人，2012 年）。壓縮應力增加是由于腫瘤體積擴大及其微環境在基質重塑時變硬的組合，這發生在乳腺癌或胰腺癌等幾種腫瘤類型中?；|重塑主要由基質細胞（如腫瘤相關成纖維細胞）協調，主要包括 ECM 的地形擾動和硬化，并且已知有利于侵襲和轉移（Clark 和 Vignjevic，2015；Goetz 等，2011；Pickup 等。 , 2014 年），特別是通過膠原蛋白交聯、整合素聚集（Levental 等人，2009 年；Paszek 等人，2005 年），更重要的是通過誘導由徑向排列的纖維形成的路徑（Provenzano 等人，2006 年）。然后，這些軌跡可用于在主要成纖維細胞的幫助下進行集體腫瘤細胞遷移（Gaggioli 等，2007）。盡管如此，基質重塑導致的壓縮應力增加的影響包括腫瘤細胞大小減少、增殖缺陷和細胞周期阻滯、體外研究時總體損害腫瘤生長（Delarue 等人，2014 年；Taubenberger 等人，2019 年） . 由于腫瘤體積擴大、壓縮應力增加和 ECM 變硬，通常發現癌組織比健康組織更硬。在臨床水平上，惡性腫瘤確實被證明比良性腫瘤更堅硬（Lorenzen 等人，2002 年；Venkatesh 等人，2008 年）。除了導致壓縮應力外，封閉的原發性腫瘤環境也有利于癌細胞的集體侵襲而不是單細胞侵襲（Haeger et al., 2014）。這種影響可能會推動侵入性、即將成為 CTC 簇的內滲，與單個 CTC 相比，其轉移潛力增加了 50 倍（Aceto 等人，2014 年）。有趣的是，已發現腫瘤細胞簇在某些模型中表達 keratin-14（Cheung 等人，2016 年），這可能與剛度增加有關（Seltmann 等人，2013 年）) 與經歷上皮間質轉化 (EMT) 的腫瘤細胞相比，例如顯示波形蛋白的高表達。腫瘤細胞聚集對腫瘤細胞的機械特性和機械適應性的影響目前仍然是一個黑匣子，也將在本綜述中進行簡要推測。

圖 1。推測性研究腫瘤細胞剛度在整個轉移級聯過程中的作用

侵襲、遷移、內滲、循環、阻滯、粘附和外滲都以不同方式挑戰腫瘤細胞的機械特性，并有利于不同的機械表型。

癌細胞不僅在原發性腫瘤環境中暴露于機械應力，而且在血管內注入后也非常顯著，因為它們在血流中移動并通過轉移級聯的血管內步驟（Follain 等人，2020）。一旦它們在血流中（或淋巴管內）循環，腫瘤細胞就會暴露于*不同的機械應力（圖 1），這些機械應力來自血流動力學和血管收縮。如果 CTC 要成功完成轉移級聯反應，就必須應對這些壓力（Follain 等人，2020 年）。例如，高水平的流體剪切應力 (> 1 Pa) 已被證明會誘導細胞周期停滯 ( Chang et al., 2008) 甚至在腫瘤細胞循環時破壞它們 ( Regmi et al., 2017 )。后，只有少數 CTC 可能能夠擺脫流體剪切應力的影響，并有機會阻止并粘附到內皮細胞上。值得注意的是，CTC 簇也被證明可以穿過毛細血管大小的血管，這可能會提供額外的保護（Au 等人，2016 年）。

兩種模型普遍適用于血液循環中的 CTC 阻滯：它們可以通過主動粘附到血管壁上來阻滯（Follain 等人，2018 年；Osmani 等人，2019 年），或者如果血管地形紊亂和/或通過閉塞進行阻滯。小直徑（Entenberg 等人，2018 年；Headley 等人，2016 年；Kienast 等人，2010 年；Paul 等人，2019 年；Wirtz 等人，2011 年）（圖 1）。后一種情況通常發生在微毛細血管中，CTC 被擠壓，因為它們需要通過緊密的收縮平流以到達其靶器官附近的外滲部位。后，在血管周圍區域的 CTC 外滲后，開始成功的大轉移生長。在此步驟中，轉移細胞需要越過血管壁或血腦屏障（在腦轉移的情況下）等限制性障礙，以進入休眠或擴張，作為威脅生命的轉移的基礎。

腫瘤細胞在轉移級聯的這些連續階段中遇到的所有機械應力都明確地影響了它們的內部機械狀態。通過微調它們的機械特性，腫瘤細胞可以適應在每個步驟中威脅轉移進展的各種機械應力。特別是，他們自己的可調機械表型可能是應對此處討論的壓力的關鍵。盡管這很可能發生，但據我們所知，只有有限的證據表明，腫瘤細胞在通過轉移級聯的過程中接受特定的機械或其他線索后會改變其機械特性。我們想借此機會討論這些概念，并推測腫瘤細胞的機械特性如何沿著級聯進化。舒爾茨，2018 年；孫等人，2014；Sunyer 等人，2009 年）。在這篇綜述中，我們簡要討論了腫瘤細胞在轉移過程中的力學特征，補充、更新和擴展了關于該主題的現有綜述（Kumar 和 Weaver，2009 年；Suresh，2007 年；Wirtz 等人，2011 年））。我們還討論了如何啟動、控制和擾動這些機械配置文件。我們進一步推測它們的變形能力如何促進腫瘤轉移，并強調為什么這些方面將成為未來研究的重要途徑。我們終提出了這樣一種觀點，即明確定義的癌細胞靜態機械表型的圖片與成功導航轉移旅程所需的不同機械特性不相容。相反，動態調整這些要求的能力可能是成功轉移癌細胞的機械特征。

測量細胞力學：方法、結果和局限性

迫切需要獨立于腫瘤力學考慮單細胞力學。到目前為止，主要通過觀察整個腫瘤或其相關基質來研究腫瘤的機制。，大多數實體瘤的組織比健康組織更硬，這實際上在手動觸診中得到了利用（Levental 等人，2009 年）。然而，一個腫瘤作為一個整體的剛度不能從構成它的單個腫瘤細胞的剛度推導出來。先，它由許多可能影響腫瘤硬度的額外基質成分（ECM、 Eble 和 Niland，2019 年；基質細胞，Denton 等人，2018 年）組成。其次，許多獨立研究報告說，腫瘤細胞實際上比健康細胞更柔軟（Alibert 等人，2017 年）即使在急性腫瘤切片中測量（Plodinec 等人，2012 年）。這一共識是通過使用各種不同的工具和方法達成的，這些工具和方法可用于在許多研究中研究單細胞力學。盡管這些方法不會成為本次審查的重點，因為其他審查已經*涵蓋了它們（Darling 和 Di Carlo，2015；Urbanska 等人，2020；Van Vliet 等人，2003；Wu 等人，2018），我們簡要討論先驅工具以及新的十分*的工具（見表 1) 以提供對該領域發展方式的一些見解。然后，在討論這些結果的局限性之前，我們將報告這些方法在腫瘤細胞硬度方面的發現。

表 1。用于測量癌細胞機械性能的精選技術概述

由于顯微鏡的發明，在細胞次可視化成為可能后不久，人們就提出了有關細胞力學以及探測它們或見證它們重要性的方法的問題（Pelling 和 Horton，2008 年）。從那以后，人們已經采取了許多步驟來發明現在可用的許多現代設備。微量吸管 (MPA) 在 1950 年代次使用（Mitchison 和 Swann，1954) 并代表了個廣泛使用的工具，用于探測至今仍在使用的單細胞機械性能。其原理在于在微量移液器尖頭施加負壓，從而在玻璃毛細管內吸出部分細胞并監測隨著時間的推移吸出的細胞長度。存在多種不同的連續模型來提取細胞的流變參數（González-Bermúdez 等人，2019 年；Hochmuth，2000 年）。MPA 可用于研究貼壁細胞和懸浮細胞的力學。它終被原子力顯微鏡 (AFM) 取代，成為單細胞力學分析的黃金標準 ( Dong et al., 2016 ; Radmacher et al., 1996 ; Thomas et al., 2013）。AFM 以相反的方式探測細胞的機械性能，方法是在細胞中進行壓痕而不是吸氣。雖然通常僅限于測量粘附在表面上的細胞，但它的廣泛接受源于它堅固而敏感的事實。一個明顯的優勢是使用不同大小的探針，它允許記錄整個細胞表面的全細胞剛度和亞細胞剛度圖。這個范圍構成了非常不同的機械測量，例如，從膜彎曲剛度和質膜下的局部細胞骨架結構到大量細胞骨架或細胞核測量。它也非常適合研究基板剛度對細胞力學的作用（盡管必須適當考慮其分析的順應基板的存在；Rheinlaender 等人，2020 年）。與測量粘附在表面上的細胞相比，利用光學力的工具，例如光學拉伸器 (OS)，可以捕獲懸浮細胞并使其變形（Guck 等人，2001 年）。這種技術與 MPA 或 AFM 不同的主要特點是測量*無接觸。這種方法也是個與微流體輸送 ( Lincoln et al., 2007 ) 和分揀 ( Faigle et al., 2015 ) 相結合的方法) 開始克服先前方法所呈現的低吞吐量缺陷。然而，只有隨著微流控方法的新發展，細胞力學分析才真正變得高通量——現在接近傳統基于熒光的流式細胞儀的速度。實時變形細胞儀 (RT-DC) 是近年來開發的此類微流控技術全系列的一種變體（Otto 等人，2015 年；Urbanska 等人，2020 年）。細胞以高速 (10 cm/s) 流過微流體通道，在其中它們在沒有任何接觸的情況下因剪切應力和壓力梯度而變形。該技術允許以 >100 個細胞/秒的速率進行機械表型分析，從而在生物技術和醫學領域開辟了全新的應用。Toepfner 等人，2018 年）?？傊?，測量單細胞力學的方法有各種形狀和形式，允許在整個細胞的規?；蚣毎砻嫔细信d趣的區域的范圍內對懸浮或基板上的細胞進行表征。彈性和粘度指標都可以通過具有不同吞吐量水平的方法提取。所有這些的主要限制是它們未能提供有關原位腫瘤細胞機械狀態的信息（另見下一節）。

許多研究已經使用這些測量工具來研究單個腫瘤細胞的機械特性與其轉移潛力之間的聯系（Suresh，2007）。早在 1990 年代，MPA 實驗就發現致瘤大鼠成纖維細胞具有改變的粘彈性特性，使其與非致瘤對應物相比具有增強的變形能力（Ward 等，1991）。AFM 研究一直報告相同的趨勢。Lekka 及其同事在 1990 年代后期次使用 AFM 比較兩種正常人膀胱上皮細胞系與三種癌細胞系，發現癌細胞比正常細胞更順從（Lekka 等，1999）。對于乳腺上皮細胞系 ( Li et al., 2008 ; Liu et al., 2020 )、軟骨肉瘤細胞系 ( Darling et al., 2007 )、胃腸道腫瘤細胞 ( Suresh et al., 2005 )報告了基本相同的發現和卵巢上皮癌細胞（Xu et al., 2012）。當用于探測人類乳房活檢的硬度曲線時，AFM 顯示癌細胞構成了惡性組織中柔軟的部位（Plodinec 等人，2012 年）。此外，從肺癌、乳腺癌或胰腺癌患者身上采集的癌細胞和健康細胞的納米機械 AFM 分析顯示癌細胞軟 70%（Cross 等人，2007 年））。在后續調查中，這一數字增加到 80%（Cross 等人，2008 年）。同時，研究各種細胞形狀參數不出所料地證明了轉移性和非轉移性人骨肉瘤細胞之間存在多個顯著的幾何差異，重要的是細胞體積、細胞面積、細胞圓度和細胞伸長率（Lyons 等人，2016 年）。近一項比較同基因組腫瘤細胞變形能力的研究進一步報告說，成功轉移到肺部的細胞比循環腫瘤細胞和原發性腫瘤細胞要軟得多（Liu et al., 2020）。顯然，可變形性賦予轉移細胞選擇性優勢，可用于預測。Swaminathan 等人，2011 年）。

雖然所有這些研究都是針對附著在基質上的細胞進行的，但分離和測量懸浮細胞也保持了正常細胞和癌細胞之間的機械差異。在懸浮分離后使用 OS 測量多個乳腺癌細胞系（MCF-7、MCF-10 和 MDA-MB-231）證實了細胞彈性和轉移潛能之間的密切相關性（Guck 等人，2005 年）。這一發現得到了對 Ras 轉化上皮細胞 ( Gullekson et al., 2017 ) 的進一步研究的支持，甚至在使用相同 OS 設備從癌癥患者口腔黏膜獲得的原發性鱗狀細胞癌細胞中 ( Remmerbach et al., 2009)）。這對于新一代的微流體高通量技術來說是個好兆頭，該技術還可以測量懸浮細胞。事實上，大多數使用高通量技術的出版物確實再次證實了癌細胞的變形能力增加（Ahmmed 等人，2018 年；Ciucci 等人，2017 年；Deng 等人，2017 年；Guillou 等人，2016 年； Holenstein 等人，2019 年；Wullkopf 等人，2018 年；Zhang 等人，2012 年）。作為一個具體的例子，發現使用 RT-DC 測量的不同骨肉瘤細胞的變形能力隨著轉移侵襲性的增加而變化（Holenstein 等人，2019）。變形性細胞術的另一種變體甚至已被用于證明可以根據其變形性在患者的胸腔積液中識別出惡性細胞（Tse 等人，2013 年），使機械表型分析接近臨床應用（Guck 和 Chilvers，2013 年）。

雖然所有這些研究都表明單腫瘤細胞的變形能力和轉移潛能之間存在很強的相關性，但很少有研究發現相反的情況。一個恰當的例子是一項研究報告說，高度轉移的人類乳腺腫瘤細胞在通過 β-腎上腺素能信號傳導硬化后變得更具侵襲性（Kim 等人，2016 年）。近，膠質母細胞瘤細胞的侵襲潛力也顯示出與細胞硬度成比例，這是通過福爾明 FMN1 賦予的（Monzo 等人，2020 年）。這種差異表明，絕大多數證明的細胞順應性和轉移之間的相關性可能比看起來更復雜，這可能取決于所使用的方法（Holenstein 等人，2019 年；Wu 等人，2018 年）)，并且可能依賴于上下文。后一點對于血液腫瘤（白血?。┧坪跻呀洿_立，這也顯示出癌細胞變硬的相反趨勢（Ekpenyong 等人，2012 年；Toepfner 等人，2018 年）。這種現象可能是由于造血系統中的成熟細胞需要變形才能循環，但癌細胞不是*分化的血細胞，因此仍然比健康血細胞更硬。

缺乏代表性的背景構成了大多數上述研究的主要缺點。雖然對血癌的研究接近實現了使用微流體技術在接近其自然體內環境的環境中進行測量的目標，但實體瘤的情況有所不同：測量主要是在培養中的腫瘤細胞系上進行的因此僅代表在 2D 底物上培養后達到的特定機械狀態，這與腫瘤細胞在其轉移過程中發現自己在體內的環境幾乎沒有關系。直到允許在體內進行非破壞性的新工具細胞力學的探索已經建立，轉移性腫瘤細胞生物力學特性的發現不能與成功的轉移過程*相關。三維細胞培養代表了一種工具，可用于開始彌合這一差距并在更相關的條件下體外研究腫瘤細胞（ Lv 等人，2017 年）。后，盡管研究人員可以使用多種工具和方法來探索細胞力學，從而可以從各種不同的角度解決這個問題，但它也帶來了一個不幸的缺點，即幾乎不可能比較不同研究的結果，因為每種方法都會出現具有非常具體的參數、規則和流變指標集（Wu et al., 2018）。特別是，測量細胞的彈性和粘性模量在很大程度上取決于探測樣品的頻率或應變率以及探針的性質和尺寸（Urbanska 等人，2020 年），這進一步使得出可靠的結論變得復雜跨越不同的研究。后，不能排除在腫瘤細胞中觀察到的機械變化只是一種附帶現象和其他導致轉移進展的過程的副作用，而不是主要貢獻者的可能性，因為上述研究迄今為止只是相關的。證明因果關系是該領域接下來的重要步驟之一（Guck，2019）。

腫瘤細胞力學：被動特性和主動調節元件

到目前為止，我們已經討論了可以通過施加外力和量化產生的變形來測量的細胞的被動機械性能。然而，細胞對機械力的反應也有一個主動成分。腫瘤細胞的機械特性分為兩大類：主動和被動。任何導致腫瘤細胞或其細胞器由于施加的外力而改變形狀的內在特性都屬于被動類別。另一方面，活性特性由機械傳感干預以響應其環境線索來調整細胞的機械參數/行為的行為構成。另一種說法是內在的機械性能會影響細胞在其環境中的行為方式，但與此同時，環境可以觸發細胞中影響其機械性能的主動反應。我們在上一節討論的研究中明顯地缺失了機械性能和環境之間動態關系的這一方面。因此，迫切需要準確描述細胞力學在從原發性腫瘤到繼發性腫瘤的完整轉移過程中的作用。在本節中，我們將介紹與細胞力學有關的腫瘤細胞的結構元素，這些結構元素對細胞變形的能力至關重要。我們將他們的參與歸因于細胞力學的被動或主動方面。然而，機械傳感機制將不會詳細討論，因為它們已在其他地方進行了充分審查（環境可以觸發細胞中影響其機械性能的主動反應。我們在上一節討論的研究中明顯地缺失了機械性能和環境之間動態關系的這一方面。因此，迫切需要準確描述細胞力學在從原發性腫瘤到繼發性腫瘤的完整轉移過程中的作用。在本節中，我們將介紹與細胞力學有關的腫瘤細胞的結構元素，這些結構元素對細胞變形的能力至關重要。我們將他們的參與歸因于細胞力學的被動或主動方面。然而，機械傳感機制將不會詳細討論，因為它們已在其他地方進行了充分審查（環境可以觸發細胞中影響其機械性能的主動反應。我們在上一節討論的研究中明顯地缺失了機械性能和環境之間動態關系的這一方面。因此，迫切需要準確描述細胞力學在從原發性腫瘤到繼發性腫瘤的完整轉移過程中的作用。在本節中，我們將介紹與細胞力學有關的腫瘤細胞的結構元素，這些結構元素對細胞變形的能力至關重要。我們將他們的參與歸因于細胞力學的被動或主動方面。然而，機械傳感機制將不會詳細討論，因為它們已在其他地方進行了充分審查（Broders-Bondon 等人，2018 年；程等人，2017；Chin 等人，2016 年；霍夫曼和克羅克，2009 年；Janmey 和米勒，2011 年）。

細胞膜是細胞與其環境之間的界面，因此是受外力影響的個細胞成分（Le Roux 等人，2019 年）。細胞膜具有可以通過彎曲模量來描述的彈性特性，彎曲模量構成了決定膜抵抗彎曲變形能力的被動機械參數。彎曲模量是一種固有的細胞參數，在細胞類型之間會有所不同（Pontes 等人，2013 年）。此外，近的研究表明，細胞通過稱為小窩的小而有組織的質膜內陷積極響應和緩沖機械約束（Nassoy 和 Lamaze，2012）。這些會影響表面張力，有助于膜的機械性能，并提供一些防止膜破裂的保護（Echarri 等人，2019 年；Sinha 等人，2011 年）。此外，已知膜會對各種機械應力（例如拉伸、壓縮或剪切應力）和各種響應形式的地形線索作出積極反應，包括膜的展平、折疊或流化（Le Roux 等人， 2019 年）。總之，細胞膜涉及細胞力學的被動和主動前沿，分別具有允許變形的彈性特性及其作為細胞與其環境之間的力感應和響應觸發界面的作用。

細胞膜與細胞骨架相互作用，顯著的是位于下方的肌動球蛋白皮層。早就知道這部分細胞骨架會影響膜變形（Farsad 和 De Camilli，2003 年）。重要的是，肌動球蛋白皮層負責細胞的皮層張力。除了參與細胞僵硬、皮層張力水平或破損外，皮層張力還限制細胞變形（Chugh 和 Paluch，2018 年），并參與膜膨出（Paluch 等人，2005 年）和細胞尺度收縮（Koenderink 和Paluch，2018 年），使其成為細胞力學中的積極參與者，為小應變下的細胞變形提供主要阻力。

肌動球蛋白皮層只是細胞骨架的眾多組成部分之一，概括起來可以說包括微絲、微管和中間絲。這些不同的組件是生物聚合物，它們都具有不同的機械性能，并且能夠動態組裝和拆卸（Janmey，1991）。作為肌動球蛋白皮層對小應變變形的抵抗力的補充，中間絲負責抵抗大應變下的細胞變形，并充當安全帶，防止過度變形會破壞細胞（Charrier 和 Janmey，2016）。因此，細胞骨架作為其各部分的總和直接負責細胞的順應性，因為它控制著它們的一般粘彈性特性（Wottawah 等人，2005 年）。它的動態特性涉及細胞功能，例如細胞周期、遷移和粘附 ( Hall, 2009 )，其中細胞通過肌動蛋白重組主動變形。因此，細胞骨架不僅解釋了細胞的剛度及其承受被動變形的能力，而且還解釋了它們在各種過程中積極采用的一般細胞形狀（Bhadriraju 和 Hansen，2002）。此外，細胞骨架將細胞的細胞器定位在其細絲網絡內，使其成為轉移過程中細胞形狀/變形與關鍵細胞器重新定位之間的直接聯系。在比細胞膜更大的程度上，細胞骨架參與了主動和被動的機械過程，可以被認為是細胞力學的關鍵參與者（Fletcher 和 Mullins，2010 年）。

細胞核是與細胞骨架相連的眾多細胞器之一（Starr 和 Fridolfsson，2010 年），目前是癌癥研究領域的一個重要課題（Denais 和 Lammerding，2014 年），核膜不僅僅是一個簡單的保護屏障。它涉及對癌癥進展至關重要的各種功能，例如防止基因組改變、細胞周期調節、細胞骨架組織和細胞遷移（de Las Heras 等人，2013 年）。尤其是腫瘤細胞的侵襲在很大程度上取決于細胞核的被動機械特性和擠壓通過約束孔的能力（Harada 等人，2014 年），正如體外實驗所證明的那樣微流控系統 ( Fu et al., 2012 ) 和體內( Denais et al., 2016 ) 細胞核在經歷輪回的腫瘤細胞中劇烈變形。雖然細胞骨架能夠動態重塑以允許細胞流過約束孔，但機械約束被傳遞到細胞器，例如細胞核，這是一個相對靜態和剛性的彈性物體。這為通過非常嚴格的限制進行的重要遷移設定了硬性限制（Harada 等人，2014 年）。外力由原子核直接感知，其行為類似于機械傳感器（Shivashankar，2011 年；Kirby 和 Lammerding，2018 年) 并影響關鍵的細胞功能，例如染色質組織和基因表達。細胞還使用它們的細胞核作為標尺來測量它們的空間限制程度并相應地調整它們的行為（Lomakin 等人，2020 年）。細胞在試圖通過緊密收縮時增加施加在細胞核上的力并有利于其變形的一個關鍵機制是由 Arp2/3 蛋白驅動的快速核周肌動蛋白聚合（Thiam 等人，2016）。在這個過程中，聚集在細胞核周圍的肌動蛋白絲對核包膜施加橫向力，進而導致短暫的核層破裂，從而使核變形和腫瘤細胞通過。這種機制依賴于核纖層蛋白 A/C 的存在，它是一種中間絲和核膜的主要結構蛋白。層粘連蛋白參與保護基因組，具有機械敏感性，并且可以影響重要的轉移轉錄調節因子，例如 SRF 和 YAP/TAZ ( Irianto et al., 2016 )。lamin A/C 的水平對細胞核的粘彈性至關重要（Lammerding 等人，2006 年；Swift 和 Discher，2014 年) 并且，通過擴展，調節其在受到力時被動擠壓的能力，以允許細胞通過限制空間 ( Cao et al., 2016 )。還發現染色質與核纖層蛋白 A/C 一起有助于核變形（Hobson 等人，2020 年；Stephens 等人，2017 年）。近確定了構成核膜的脂質分布，并發現它們也在變形中起作用（Dazzoni et al., 2020）。雖然核變形僅與大應變下的細胞變形有關，但它是遷移中的一個高度限制參數。核變形不僅通過允許腫瘤細胞進行遷移來促進轉移，而且還引發了 DNA 損傷。只要核包膜和 DNA 修復系統隨后啟動以防止細胞死亡（Denais 等人，2016年）， DNA 損傷就會反過來通過驅動基因組不穩定性來增加腫瘤細胞的轉移侵襲性（Lim 等人，2016年）。例如，由反復喪失核包膜完整性引起的 DNA 損傷現在被確定為腫瘤細胞侵襲性表型的重要驅動因素（Nader 等人，2020 年）。

除細胞核外，近發現其他細胞器在轉移的情況下也具有改變的形狀和/或位置（表 2）。雖然這些改變與腫瘤細胞環境之間的關系以及它們在主動/被動機械事件中的作用目前仍不清楚，但它們可能會通過利用體內相關研究的新進展，在未來構成一個重要的研究途徑。光學和電子顯微鏡 ( Karreman et al., 2016 ) 在轉移級聯的整個步驟中跟蹤細胞器的形狀/定位（圖 2）。

表 2。細胞內細胞器概述及其在癌癥轉移中的作用

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圖 2?；铙w相關光和電子顯微鏡作為研究轉移過程中細胞變形和細胞器形狀/定位的工具

(A) 通過相關光學和電子顯微鏡 (CLEM) 獲得的 EM 圖像可以堆疊以在其環境中以 3 個維度重建腫瘤細胞體積。瀏覽生成的重建體積可以清楚地顯示關鍵細胞器的位置和形狀。細胞核呈綠色，線粒體呈黃色，溶酶體呈橙色，MVB 呈深紫色。

(B) 使用 CLEM，可以在納米級分辨率下在轉移級聯的不同步驟（侵入、循環和停滯）解剖細胞。在特寫鏡頭中，細胞核和 RER 以淺綠色突出顯示，高爾基體以深綠色突出，線粒體以黃色突出，溶酶體以橙色突出，MVB 以紫色突出。