估計 EV的 數量、確定 EV 的存在以及評估EV 制備中非 EV 組分的份額和影響等都需要對EV進行表征。EV的表征面臨著小粒徑、尺寸異質性和分子異質性、缺乏通用 EV 識別方法以及許多測量技術的非 EV 特異性的挑戰。沒有任何一種測量或方法能夠滿足所有 EV 表征的要求，因此建議使用正交方法（即沒有相同測量限制的方法）彼此驗證，也就是說EV的表征參數作為關鍵質量屬性 (CQA) 推薦采用兩種或兩種以上不同原理的方法檢測同一指標。
EV 的總體組成（蛋白質、脂質、核酸和其他生物分子等的含量及比例）因 EV 來源而異。雖然這些單個分子類別的測量可用于估計 EV 豐度，但這些值不一定與 EV 濃度全部相關，而且源材料之間也不存在普遍性；因此，它們不應用作 EV 濃度的衡量標準。正如沒有單一分子的檢測可以量化所有 EV 一樣，也沒有 EV 或 EV 亞型的通用分子標記。必須根據來源特異性和類型特異性的證據來選擇特定的標記。目前，尚無已知的通用標記可以識別所有EV，無論其來源如何。對于所謂的外泌體，這些標記的普遍性尚不清楚或不被接受。請注意，涉及四次跨膜蛋白 CD9、CD63 和 CD81 的基于親和力的方案對于作為 EV 亞型的外泌體并不具有特異性；使用針對這些四次跨膜蛋白中的某一個的抗體富集的EV群體并不能不全面覆蓋所有的分子組成。此外，并非所有 EVs都表達這些蛋白標志物，因此四次跨膜蛋白富集并不能捕獲所有 EVs。檢測同一表征參數的正交方法（不止一種原理的方法）不太可能具有相同的偏差；例如，同時通過光學方法與非光學方法分別推導和檢測EV的直徑。使用正交方法對 EV 樣本進行表征，對于證明共分離物與生物標志物或功能發現無關也至關重要。由于許多EV表征方法不是特定適用于EV的，或者無法檢測所有的EV，因此需要將方法和結果透明公布以確保EV數據的可重復性。
EV 的數量和體積測量一同定義了數濃度（以particles/mL 為單位），這是一種被廣泛報道并使用的指標。然而，它通常不可靠，因為許多技術缺乏對EV的特異性和對所有EV的敏感性。ISEV 嚴格和標準化EV參考材料工作組最近概述了測量技術的考慮因素，以及該領域在面對可追溯測量、開發和報告良好表征的EV參考材料方面所面臨的挑戰。這項工作的一個關鍵亮點是需要公布檢測方法的 LOD，從而允許其他人驗證結果，而不管靈敏度限制如何。通過使用正交方法可以提高 EV 濃度測量的可信度，每種方法都具有確定的 LOD，例如檢測光散射強度（如NTA）、熒光強度（如FCM）和物理大小（如RPS），因為正交方法沒有相同的測量限制。例如，電阻脈沖感應 (RPS) 技術，就可以用粒徑來表示 LOD。對于流式細胞術等光學技術，LOD 可以用源自光散射光學模型的直徑或源自熒光強度的等效可溶性熒光團 (MESF) 分子來報告。這些方法可以在不同儀器和靈敏度之間產生一致的數據。由于顆粒檢測涉及的變量較多，因此目前尚無方法為納米顆粒跟蹤分析 (NTA)、動態光散射 (DLS) 或成像流式細胞術得出可追溯的 LOD。對于無法區分 EV 與其他潛在共分離物或污染物的技術，無論上游分離步驟如何，都建議將濃度報告表示為“顆粒濃度或 EP 濃度"而不是“EV 濃度"。EV 大?。ㄒ约{米半徑或直徑為單位）的測量依賴于球形度或遷移率等假設，并且輸出結果可能受到上游變量的影響。常見的高通量方法，包括流式細胞術、NTA、RPS、多角度光散射和動態光散射 (DLS) 都假設 EV 是球形的。雖然“大小"和“直徑"經常在測量方法之間互通使用，但它們的推導方式也可能導致測量技術間的一致差異。例如，依賴于顆粒布朗運動的技術（如 NTA 或 DLS）測量的是流體動力學直徑，與冷凍電鏡等成像方法相比，會導致顆粒大小估計過高。而很少有方法能夠在整個EV可能的直徑范圍內（從幾十納米到微米）精確測量 EV 尺寸。例如，雖然冷凍電鏡的高分辨率成像是最準確的方法之一，但它的檢測通量相對較低，而且許多較大的 EV 往往數量較少而可能無法量化。定量低于 100 nm 的低對比度 EV 的能力也可能是一個限制因素。
隨著越來越多的研究人員使用靈敏度更高的專用單顆粒分析技術，越來越清楚的是，許多 EV 制劑表現出不對稱的右偏分布，例如對數正態分布，其中大多數 EV 直徑 <100 nm。大多數單顆粒分析技術無法解析全部的 EV 群體，因此研究者應共享檢測到的 EV 直徑分布，而不僅僅是平均大小、集中大小或中位值大小等匯總指標，這些指標很容易由于 LOD 和不對稱大小分布而傾斜。請注意，擬合大小統計數據，例如通過 NTA 對低折射率顆粒進行測量，可能更接近儀器的 LOD而不是 EV 群體的真實模態直徑。使用具有專有算法的軟件來確定粒徑的技術也可能導致軟件版本或軟件平臺之間的差異，因此也應該提供軟件及其版本。從折射率假設推導出大小的技術可能會由于不同的樣本成分和裝載物而導致變化。從熒光探針（例如膜嵌入染料）推導的大小則可能會由于基于不同膜脂成分的不同染料嵌入而導致變化。對于無法區分 EV 和共分離物/污染物的技術，無論上游分離步驟如何，建議將直徑報告表述為“顆粒"或“EP"直徑，而不是“EV 直徑"。
隨著 EV 檢測實驗和儀器的使用和專家知識的拓展，相關表征報告尺度的確定也在不斷增加，以確保數據的可靠性和可重復性。MISEV2023指南詳細列出了最小實驗和儀器特定報告的注意事項列表。無論實驗設計如何，這些通常都適用。這里列出的技術并不詳盡，許多檢測技術正在開發或正在積極研究。然而，所列出的技術都是商業上可獲得的，并且有來自多個研究人員的發表文獻。（由于篇幅限制，筆者在此只列出當前常用的幾種EV粒徑和濃度表征工具的描述及其主要觀點）ISEV建議，對照組應包括作為檢測抗體的同型抗體，或同型偶聯的捕獲微珠，以及僅含有檢測抗體的捕獲微珠（用于抗體包被的捕獲珠）；應使用多個 EV上樣濃度來展示信號的滴定；如果制備微珠，應公布其試劑和化學成分；商業捕獲微珠試劑的目錄和批號也應公布；公布標準化微珠的中位熒光強度值；公布來自單態圈定微珠的等效可溶性熒光團 (MESF) 分子的數據和中位熒光強度值統計（與單 EV 流式細胞術一樣）；應公布完整且詳細的方法學。2023年，經由國際細胞外囊泡學會（ISEV）、國際細胞計數進步學會、國際血栓與止血學會組成的三學會工作組（EV流式細胞術工作組）倡議，出版了《單EV流式細胞術綱要》，全面解決開發單 EV 流式細胞術檢測的注意事項。樣本體積、熒光和光散射參數的校準對于單 EV 流式結果的解釋和復制至關重要。如果使用單 EV 流式細胞儀報告顆粒濃度，請確定LOD的上限和下限，以允許使用正交方法或其他人來重復和驗證該結果。目前，成像細胞儀使用動態觸發方法，這使得較低 LOD 的確定難以定義，因此難以標準化。DLS，也稱為光子相關光譜 (PCS) 和準彈性光散射 (QELS)，是一種能夠確定稀釋水溶液分散體中充分單分散顆粒的流體動力學直徑的技術。DLS 測量溶液中多個顆粒散射的激光強度的自相關函數。自相關函數攜帶有關顆粒擴散系數的信息，該信息通過斯托克斯-愛因斯坦布朗運動理論與流體動力學直徑相關。可以使用多種算法從測量的自相關函數導出擴散系數。最常見的方法是累積量分析，但是它假設樣本都是單分散的大小分布，而 EV 樣本是不具備這種分布的。對于 EV 樣本的多分散大小分布，擴散的推導自相關函數的系數分布成為一個不適定的數學問題。這意味著 DLS 不應用于確定 EV 樣品的定量屬性，除非 DLS 應用于 EV 的具有單分散尺寸的某一部分。另一方面，DLS 可用于定性確認 EV 樣品中可能存在的亞微米顆粒和可能的聚集體的存在。各種電子顯微鏡 (EM) 是少數能夠檢測EV（無論大小如何）的技術之一。然而，電鏡的通量也意味著與較小的EVs相比，較大的EVs在統計上會被低估。SEM、TEM和Cryo-EM都是高分辨率的EV表征方法，它們也不必互相切換或能夠提供具有質量可比的圖像。例如，Cryo-EM可以清楚地顯示脂質雙層結構，比TEM用于固定樣品的脫水條件更好地保持了 EV 形態，并且可能更加準確定量（大?。?/strong>因為一定體積中的所有顆粒都可以成像，而不僅僅是那些粘附在載網表面上的顆粒。為確定低報告要求而對 EM 方法進行的標準化研究非常有限。對于 TEM，應公布三個主要參數：固定、吸附和負染色方法。固定包括：使用的固定劑及其濃度和孵育時間；吸附包括載網材料、載網尺寸、薄膜類型、涂層、孵育時間和清洗細節；負染色的詳細信息應包括底物、濃度和孵育時間。并且，應公布低倍率和高倍率圖像以及圖像的選擇標準。NTA，也認為是一種單顆粒跟蹤，是 EV 領域廣泛使用的一種光學技術，用于估計顆粒尺寸和濃度。NTA 通常采用減少直徑分布變化的算法，通過測量顆粒的擴散系數得出流體動力學直徑。值得注意的是，某些NTA設備上使用的 FTLA 算法是為了更好地表示單分散混合物而開發的，而 EV 則不然，這可能會導致人為的多種擬合分布。并且，目前沒有方法可以確定或公布 NTA 設置 的LOD。很多學者已經進行了幾項標準化研究來比較用戶和儀器之間的結果。使用 NTA 測量復雜生物流體樣本的直徑分布和濃度應謹慎解釋，因為它會對脂蛋白和大蛋白復合物等共分離物進行計數，并且NTA難以量化直徑在幾百納米以上的 EV。對于 NTA 的公布信息，應包括儀器型號、相機類型、相機設置、激光波長、激光功率、軟件版本、分析設置和每幀粒子。如果已知，則應公布用于生成直徑分布的算法，因為根據所使用的算法可能會產生不同的結果。在光散射或熒光檢測模式的情況下，建議使用空白緩沖液作為對照。對于熒光 NTA，報告光散射模式下的總顆粒數以及熒光模式下的標記顆粒數，以及標記去除方法和緩沖液/試劑控制從而評估標記的偽彩情況。如果使用了流體上樣裝置也應將其設置公布。這是MISEV第一次將電阻脈沖感應 (RPS) 技術作為與基于流式的方法（包括基于微珠的流式和單EV流式）和基于顯微鏡的方法（包括原子力顯微鏡、電鏡、DLS、NTA、超分辨顯微鏡等）并列推薦的常用EV顆粒表征方法。也是為數不多的非光學原理的EV表征技術之一。RPS利用庫爾特原理來確定顆粒的濃度和直徑，以及某些設備還具備zeta 電位功能。目前 RPS 的直徑LOD低至 ～50 nm。文獻報道，RPS 測量結果確實與 TEM 數據具有非常高的一致性。報告 RPS 數據時，建議公布儀器型號、孔徑、校準微珠直徑和來源以及軟件版本。如之前所述（顆粒大小的定量），對于 EV 數據，推薦公布RPS的直徑分布而不是單一直徑統計數據。并且建議納入空白緩沖液的對照來識別背景，以及相同濃度的去污劑裂解后的樣品以確定標記事件。由于 RPS 技術很容易被較大顆粒堵塞，因此可以使用離心或過濾等分析前步驟來去除較大顆粒。由于這些方法可能會改變正在分析的 EV 群體并影響與正交方法的比較，因此應明確說明任何分析前處理程序。需提供蛋白質富集和定量的詳細信息；如果可能，需包括抗原的陽性和陰性對照 ；如果聲稱蛋白質與 EV 相關，需要包括 EV 制劑的純度測量。報告標準化上樣、凝膠電泳、轉膜方法、探針和成像/分析的所有詳細信息（包括但不限于抗體信息、樣品變性和還原條件、轉膜方法、膜類型、緩沖液以及成像設備和參數）；提供所有WB的未裁剪圖像（如果在期刊上發表，則需要作為補充信息）。該指南在以上各章節中，分別討論了 EV 表征的不同方法，并提供了具體建議。無論采用何種方法，表征的總體建議總結如下：- 每種 EV 制劑應通過 EV 來源的定量測量來定義（例如，分泌細胞的數量、生物流體的體積、組織的質量等）。
- 應估算 EV 的豐度（包括顆粒數量、蛋白質和/或脂質含量）。
- 應檢測 EV 制劑是否存在與 EV 亞型或EV 相關的成分，具體取決于實驗目的所需的特異性。
- 當使用定量指標表征 EV 時，需提供儀器或方法的檢測限 (LOD) 。
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