免疫比濁法是目前非常主流的一種免疫檢測方法，其基本原理為：抗原抗體在緩沖液中特異性結合形成抗原抗體復合物，使反應液出現(xiàn)濁度，透光率下降。在一定的比例范圍內(nèi)，反應液的濁度和抗原抗體的量呈線性相關關系，從而得到樣液中抗原的含量。
免疫比濁中抗體的載體主要是膠乳微球，常見的膠乳微球由苯乙烯及相應功能單體通過乳液聚合法制得，粒徑范圍為50nm至400nm的一種納米材料。膠乳微球的粒徑會影響免疫比濁靈敏度大小、抗體投入量多少、包被微球的抗體活性及微球本身穩(wěn)定性等，因此精準監(jiān)控膠乳微球的粒徑分布情況，團聚、分散等狀態(tài)也成為微球的生產(chǎn)包被工藝流程中的重難點。
免疫比濁試劑的研發(fā)過程中，需要對裸露的膠乳微球進行包被以及封閉操作，而在微球包被、封閉結束后，通常需要通過高速離心的方法去除多余的蛋白和封閉劑，在離心之后又需要超聲使微球均勻懸浮在液體當中。令人頭疼的是，超聲不足，微球不能充分分散；超聲過度，可能造成抗體或封閉劑從微球表面脫落，容易造成微球聚集、沉淀。
微球顆粒越大、濃度越高吸光度也會增大，所以經(jīng)常會用紫外分光光度法測量微球的吸光度來反應微球樣本的團聚或者濃度情況。筆者通過紫外分光光度法研究了150nm微球包被前后的變化情況，檢測了包被前的裸露150nm微球的吸光度為0.68A，包被后微球吸光度為1.11A，就說明包被后樣本團聚嚴重。超聲分散后，檢測微球吸光度為0.60A，此時微球吸光度與裸微球的吸光度相近，說明微球已超聲分散好，可以用于后續(xù)實驗。
但發(fā)現(xiàn)后續(xù)實驗結果與預期有較大的偏差。猜想雖然包被后超聲的微球吸光度與裸微球的吸光度相近，但微球的狀態(tài)很可能不一樣，而紫外分光光度計無法檢測到這樣的細節(jié)，分辨率較低。因此需要一款高精度的納米顆粒表征儀器，目前高精度的納米單顆粒表征方法有納米粒子示蹤（NTA）、納米流式、納米庫爾特粒度儀（Nanocoulter），但是前兩種方法都是光學方法，易受樣本的光學性質(zhì)影響。Nanocoulter運用RPS（電阻感應脈沖）原理，RPS作為電學的檢測方法，不存在大小顆粒互相影響的現(xiàn)象，是真正意義上的單顆粒檢測方法，反映樣本最真實的粒徑分布。而且不受樣本吸光度、折光率影響，與樣本光學性質(zhì)無關，擁有非常高的分辨率，可以精確看到樣本團聚等細微變化。
筆者選用了Nanocoulter檢測微球包被過程中各步驟的顆粒濃度。數(shù)據(jù)顯示150nm裸微球濃度為5.338E+11（Particles/mL），且粒徑集中在150nm處，樣本中只有微量團聚體，微球的均一性很好；包被后的微球，樣本中的團聚明顯增多，與吸光度反映一致；而包被微球超聲后，濃度為4.602E+11（Particles/mL），相比裸微球，包被后超聲微球濃度明顯下降，樣本損失了13.8%。而且超聲后的微球并沒有分散好，樣本中還有10%左右的團聚顆粒。
至此，筆者確定先前引起吸光度降低的原因，就是因為工藝過程中微球的損失導致。另外，超聲后吸光度雖降低，但微球中其實還是有部分團聚體，這種情況是分光光度計無法準確分析的。甚至因為損失，分光光度計還會在遇見團聚體時給出“分散較好"的誤導信息！但實際上，微球吸光度一致時，微球的團聚情況也可能不同。
總結
納米庫爾特粒度儀（電阻法RPS）在免疫比濁試劑生產(chǎn)研發(fā)中有明顯優(yōu)勢：
1. 粒徑測量媲美電鏡，可以準確展示微球的粒徑分布，分析團聚情況；
2. 精準的濃度測量，分析微球包被工藝當中的損失及分散情況；
3. 真正意義上的單顆粒檢測，展示樣本的原始面貌。
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