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武漢尚恩生物生產的支原體PCR檢測試劑盒（巢式PCR）采用巢式PCR法(Nested PCR)以提高支

原體檢測的靈敏度和和特異性。基本原理是，先在支原體rRNA上的16S和23S上設
計一對引物，用于擴增部分16S-23S之間的保守區以及全部的其間間隔區，保守區
可以用于判斷是否存在支原體污染。

產品名稱	支原體PCR檢測試劑盒（巢式PCR）
貨號	SNCD-001
規格	250次（20ul體系）
簡介	支原體（Mycoplasma）別名霉形體，直徑0.1-0.3um，具有高度多樣性，是一種沒有細胞壁、可以用人工培養基培養增殖的最小的原核生物。其廣泛存在于人和動物體內，大多數不致病。由于其廣泛存在，外加體積較小可以通過濾膜混入細胞培養體系，也很難通過普通光鏡觀察到，普通抗生素對其也沒有有效的抑制作用，因此成為細胞培養中比較常見而且難以檢測清除的污染。 支原體污染對細胞會有多方面的影響，包括以下方面：1.細胞生長速度改變；2.細胞形態、狀態改變；3.細胞染色體異常、突變甚至功能改變；4.細胞對環境沖擊耐受力降低；5.相關細胞實驗獲得的數據異常等。可以說對細胞及細胞相關實驗有極其嚴重的影響，因此檢測及清除廣泛存在的支原體污染成為諸多實驗室必須要經歷的過程。 支原體污染無法通過肉眼或者普通光鏡直接判斷，只能通過各種試劑、儀器檢測。支原體常規檢測方法有：熒光法、培養法、電鏡法、常規PCR法、一步PCR法、化學發光法等，不同檢測方法能夠檢測的支原體種類不同，其檢測靈敏度、特異性、便捷性也有各自的特點。 本公司生產的支原體PCR檢測試劑盒采用巢式PCR法(Nested PCR)以提高支原體檢測的靈敏度和和特異性。基本原理是，先在支原體rRNA上的16S和23S上設計一對引物，用于擴增部分16S-23S之間的保守區以及全部的其間間隔區，保守區可以用于判斷是否存在支原體污染，因此初次PCR產物即可初步判定是否存在支原體污染；其次，在23S和間隔區設計第二對引物，保證第二對引物目標序列在第一對引物目標序列之內，形成巢式結構，然后使用第二對引物對初次PCR的產物進行二次擴增，可以大大提高檢測的特異性和靈敏度。原理圖如下：
使用方法	1.客戶需要自備的試劑、儀器 <1>待檢測樣品：細胞上清、血清或者培養基、細胞DNA。 細胞上清建議使用培養細胞3-5天的上清，培養時間過短的上清支原體含量較低可能無法有效檢出，血清或者培養基也應在培養箱靜置培養1-2天使支原體有一定程度增殖再用于檢測；細胞懸液無法直接用于檢測，需要提取總DNA后檢測，添加量為PCR體系的1/20或更少。 <2>儀器、試劑 a.PCR相關：PCR儀、無菌PCR管、微量離心機 b.電泳相關：瓊脂糖凝膠、電泳儀、電泳緩沖液、DNA marker、DNA染色液 c.通用：移液器、無菌Tip頭、離心管等 2.實驗步驟 <1>1st PCR a.按以下表格加入各反應試劑 b.1st PCR反應參數： STEP1 (起始變性): 94oC 30sec STEP2 (變性): 94oC 30sec STEP3 (退火): 55oC 2min STEP4 (延伸): 72oC 1min STEP5 (循環): Go To STEP2 for 30 cycles STEP6 (最終延伸): 72oC 5min STEP7 (臨時保存): 4oC forever <2>2nd PCR a.按以下表格加入各反應試劑 b.2nd PCR反應參數： STEP1 (起始變性): 94oC 30sec STEP2 (變性): 94oC 30sec STEP3 (退火): 55oC 2min STEP4 (延伸): 72oC 1min STEP5 (循環): Go To STEP2 for 30 cycles STEP6 (最終延伸): 72oC 5min STEP7 (臨時保存): 4oC forever 3.結果檢測 <1>取2次PCR產物各10uL，通過瓊脂糖凝膠電泳并染色觀察目的條帶。由于不同類型的支原體擴增出來的條帶大小不一，因此通過條帶大小可以粗略判斷支原體類型，如需要進一步檢測確定，建議對產物進行測序比對。 <2>結果示例 2nd產物    1st 產物    Marker
產品組分
存儲條件	-20℃（避免反復凍融）
保質期	-20℃一年（避免反復凍融）

注意事項：
1.該產品-20度可以保存一年以上，但反復凍融或保存不當可能會導致引物或陽性對照失效，如需多次使用，建議小量分裝。
2.該試劑盒確認可以檢測Mycoplasma arginini 、Mycoplasma arthritidis  等12種支原體，但無法檢測人肺炎支原體。
3.該產品僅供科研使用，不得用于診斷或臨床實驗。