1、蛋白截留不住?蛋白損失嚴重?該怎么選擇選對截留分子量?
您是否苦于超濾管流速慢呢?很有可能是截留分子量選小了。
截留分子量是根據已知分子量(以道爾頓為單位)的溶質保持>90%的能力而給出的額定值。對于蛋白質,建議選擇的截留分子量是需要截留的溶質分子質量的1/6-1/3。如果首先考慮流速的因素,則選擇需要截留的溶質分子質量的1/3作為膜的截留分子量;如果截留效果作為主要考慮,則選擇需要截留的溶質分子質量的1/6作為膜的截留分子量。另外,由于不同系列產品的工藝不一樣,更換產品系列時,適合的截留分子量有時候是會變化的。
2、濃縮后我發現濃縮液中沒有目的蛋白,可能的原因是?
首先,超濾管的低起始蛋白濃度為01mg/ml.請確保您的樣本的起始濃度大于這個濃度。其次,如果問題仍然出現。請不要丟棄您的樣本濾過液,以做下一步分析:
1)如果您的樣本在濾過液中,那么請排查:
a)您是否選擇了合適截留分子量的超濾管(目的蛋白分子量的1/2或者1/3)?
b)使用的離心力是否是在最高范圍內?如果您使用的是rpm,請換算成相應的g離心
c)離心機最近是否有校準過?
d)您是否嘗試這個蛋白?如果能確保您用同樣的超濾管對其他蛋白成功操作的話,那么有可能是您的目的蛋白的原因。有時蛋白會因其本身的一些特性(構象差異)而影響濃縮效果,建議選用上一分子量級別的超濾管(如原本選用30K,此時可以選擇10K)。
2)如果您的樣本也不在濾過液中:
a)您的樣本起始蛋白濃度是否大于0.1mg/ml?
b)您用來確定樣本濃度的方法是什么?是否可信?
c)您的目的蛋白是不是沉淀了?如果是,具體解決方法請參考上面的關于蛋白沉淀的方法。
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