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傷口感染是指傷口在愈合過程中仍被細菌或其他微生物感染的疾病。與急性傷口不同，慢性感染性傷口通常經歷較長時間的愈合過程或無法愈合，給患者帶來了嚴重的后果和沉重的負擔。傳統上，感染傷口的治療方法主要包括定期傷口清創、口服抗生素、抗菌敷料等。但是這些方法都有一定的局限，首先，細菌在傷口部位產生的生物膜形成物理屏障，限制抗菌劑或生物大分子滲透到深部組織，從而顯著降低藥物遞送效率；其次，抗生素的誤用和過度使用是增加抗生素耐藥性風險的主要驅動因素，抗生素耐藥性已成為嚴重的全球健康問題；此外，頻繁更換敷料，可能會導致傷口疼痛和繼發性損傷，從而顯著降低患者的依從性。因此，非常需要研發一種新的傷口愈合治療策略。

基于此，武漢大學藥學院黎威教授團隊設計開發了一種具有長效抗菌效果的活性益生菌微針貼片，用于治療慢性感染傷口。該微針貼片是利用摩方精密 microArch® S240 （精度：10μm）3D打印設備加工模具后經PDMS翻模制備而成，相關研究成果以“Accelerated infected wound healing by probiotic-based living microneedles with long-acting antibacterial effect"為題發表在期刊《Bioactive Materials》上。武漢大學藥學院碩士研究生靳銀麗、武漢大學中南醫院藥劑科盧云、武漢大學藥學院博士研究生江雪為共同第一作者，武漢大學藥學院黎威教授、武漢大學中南醫院整形美容科郭亮主任醫師為共同通訊作者。

該微針貼片（5% GL MN）由聚乙烯醇（PVA）、蔗糖、5%甘油和羅伊氏乳桿菌制成。其中，PVA-蔗糖基質為5% GL MN提供足夠的機械強度，促進5% GL MN在插入皮膚后快速溶解，從而實現羅伊氏乳桿菌的快速遞送；羅伊氏乳桿菌可以代謝甘油產生具有抗菌作用的羅氏菌素，從而在慢性感染傷口處實現抗菌、減少炎癥、促進傷口愈合的作用。值得注意的是，在5% GL MN中加入的甘油不僅不影響羅伊氏乳桿菌的存活，而且還為羅伊氏乳桿菌持續產生羅氏菌素提供了充分來源，從而在傷口深處實現長效抗菌和抗炎作用。

圖1.用于慢性感染傷口愈合的5% GL MN示意圖。（a）含有羅伊氏乳桿菌的5% GL MN示意圖。（b）羅伊氏乳桿菌具有抗菌和抗炎作用的工作機理。（c）5% GL MN具有長效抗菌作用，可加速感染傷口愈合。

首先采用真空輔助微成型方法制備GL MNs 貼片，并對微針的形貌、機械強度、穿刺皮膚的能力、溶解速度以及釋藥效率等進行一系列表征。

圖2. GL MNs貼片的制造和表征。（a）GL MNs貼片的制作過程示意圖。（b）具有不同甘油濃度的GL MNs 貼片的代表性明場顯微鏡圖像。（c）分別含有0%、2.5 %和5 %甘油的GL MNs 貼片的力-位移曲線。（d）GL MNs 貼片插入豬皮膚后的代表性明場和熒光顯微鏡圖像。（e）施用GL MNs貼片后豬皮膚的組織學切片圖像。（f）GL MNs貼片施用于豬皮膚后不同時間的代表性明場顯微鏡圖像。（g）施用于豬皮后殘留微針長度的定量分析。（h）GL MNs 貼片在PBS中的累積藥物釋放。每個點代表平均值±SD（n = 3），***P < 0.001。

制備的GL MNs 貼片結構為基底半徑200 μm，高度850 μm，尖部半徑～10 μm的錐形，微針排列成10×10陣列，面積為7 mm×7 mm。羅伊氏乳桿菌以良好的形態封裝在微針內。液相色譜-質譜聯用（LC-MS）結果顯示，羅伊氏乳桿菌產生的物質中存在與3-羥基丙醛（3-HPA）相對應的分子離子峰（M=74.0607），這表明羅伊氏乳桿菌具有產生抗菌物質羅氏菌素的能力。定量分析表明，5 % GL MNs 中的羅伊氏乳桿菌能產生更多的羅氏菌素。而羅氏菌素可以引起大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞桿菌的顯著形態變化，據推測，羅氏菌素通過抑制細菌核糖核苷酸還原酶的活性，而核糖核苷酸還原酶對DNA合成至關重要，從而實現廣譜抗菌活性。

圖3. 5% GL MN 貼片的表征和羅氏菌素的抗菌作用。（a）5% GL MN 貼片（b）5% GL MN貼片單根針的橫截面和（c）從5% GL MN 貼片中提取的羅伊氏乳桿菌的FESEM圖像，（b）中的黃色箭頭表示微針中存在羅伊氏乳桿菌。（d）對5% GL MN 貼片中羅伊氏乳桿菌產生的羅氏菌素的LC-MS分析。（e）含有不同濃度甘油的GL MNs貼片產生羅氏菌素的定量分析。（f）大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞桿菌用羅氏菌素治療后形態的代表性FESEM圖像。每個點表示平均值± SD（n = 3），*P < 0.05，***P < 0.001。

隨后，為了進一步評估5% GL MN貼片的抗菌效果，通過細菌的活死染色實驗、平板涂布和抑菌圈實驗來驗證5% GL MN貼片具有良好的抗菌效果。此外，5 % GL MN貼片在體外也顯示出有效的金黃色葡萄球菌生物膜清除率，這通常在有害細菌的耐藥性中起關鍵作用。

圖4. 5% GL MN貼片在體外的抗菌作用。（a）金黃色葡萄球菌與GL MNs貼片孵育24小時后的活/死測定。（b）GL MNs貼片處理后大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞桿菌的細菌死亡率。（c） LB瓊脂平板的代表性明場圖像，顯示大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞桿菌在與不同GL MNs貼片孵育24小時后的生長情況。（d）接受不同GL MNs貼片處理24小時后LB液體培養基中大腸桿菌，金黃色葡萄球菌或銅綠假單胞桿菌的OD600值。（e）不同GL MNs貼片處理24小時對大腸桿菌，金黃色葡萄球菌或銅綠假單胞桿菌抑制區的代表性明場圖像。紅色虛線圓圈表示對藥敏片的位置，黑色虛線圓圈表示抑制區。（f）對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌或銅綠假單胞桿菌的抑制區的直徑。每個點代表平均值±SD（n = 3），***P < 0.001。ns 表示無顯著性差異。

圖5. 5% GL MN貼片體外的生物膜清除效果。（a）金黃色葡萄球菌接受不同治療后的共聚焦激光掃描顯微鏡圖像。綠色：活細菌。（b）不同微針處理后用結晶紫染色的生物膜圖像。（c）金黃色葡萄球菌在（a）中接受不同處理后的生物膜清除率。（d）金黃色葡萄球菌在（b）中用不同微針處理后的生物膜清除率。每個點表示的平均值±SD（n = 3）。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。ns 表示無顯著性差異。

緊接著，通過流式細胞術、實時定量聚合酶鏈反應（qPCR）、蛋白質印跡（WB）驗證了基于羅伊氏乳桿菌GL MNs貼片的抗炎作用。

圖6. 體外GL MNs貼片的抗炎特性。（a）流式細胞術分析不同組的RAW 264.7的細胞內CD86的熒光強度。（b）不同組的流式細胞術直方圖。（c）不同組的CD86相對表達水平。（d-e）不同處理后通過qPCR測定RAW 264.7細胞中IL-6和TNF-α的表達水平。（f-h）不同處理后通過蛋白質印跡法測定RAW 264.7細胞中IL-6和TNF-α的表達水平。每個點表示平均值±SD（n = 3），*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

基于GL MNs貼片的形態、皮膚穿透能力、機械強度、溶解速度和抗菌功效等方面的表征，確定5 % GL MN是遞送羅伊氏乳桿菌到傷口處進行抗菌的最佳方案。之后，細胞活死染色實驗及細胞溶血實驗證明了5% GL MN貼片在體外具有優異的生物相容性。羅伊氏乳桿菌在5% GL MN貼片中的穩定性對于維持其抗菌活性至關重要，將5% GL MN貼片在4℃和25℃下分別保存，羅伊氏乳桿菌在室溫下可在5% GL MN貼片中存活7天，超過40%的活菌保留在貼片中；將貼片置于4℃時，羅伊氏乳桿菌在60天后仍保持高活力（>80%），這表明羅伊氏乳桿菌在5% GL MN貼片中具有長期穩定性。

圖7. 5% GL MN貼片的細胞毒性和穩定性。（a）接受不同處理后NIH-3T3細胞的活/死測定。（b） 接受不同處理后 NIH-3T3 細胞和 HUVEC 細胞的活力分析。MRS瓊脂平板的明場圖像顯示0%和5% GL MN貼片中羅伊氏乳桿菌在25℃（c）或4℃（e）下儲存時細菌活力隨時間變化情況。在25℃（d）或4℃（f）下儲存不同時間后，0%和5% GL MN貼片中羅伊氏乳桿菌的菌落計數。每個點表示平均值±SD（n = 3）。

然后，在小鼠身上建立全層皮膚傷口模型，將5% GL MN貼片施用于傷口處，可以看到5% GL MN貼片可以促進傷口的愈合，并且對傷口處的金黃色葡萄球菌有持續的抑制作用。

圖8. 5% GL MN貼片在體內的抗菌作用。（a）體內實驗的時間方案。（b）小鼠接受不同治療后第0、3、5、7、9天皮膚傷口的代表性圖片。黑色虛線圓圈表示原始傷口區域（直徑：1厘米）。（c）9天內不同組的傷口形態變化示意圖。（d）不同組在第 0、3、5、7和9天從傷口組織中分離出的金黃色葡萄球菌菌落的代表性圖像。（e）不同處理的小鼠皮膚傷口剩余面積比例-時間曲線。（f）不同組在第 0、3、5、7 和9天從傷口組織中分離的金黃色葡萄球菌菌落計數。（g）小鼠接受不同治療后的體重變化。每個點表示平均值±SD（n = 7），*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。ns表示無顯著性差異。

最后，對小鼠傷口處皮膚進行病理學切片染色，H&E、Masson、IL-6、CD31染色表明，5% GL MN貼片具有良好的促進傷口愈合、減少炎癥反應、促進血管生成的作用。

圖9. 不同治療后的組織再生、炎癥反應和血管生成。第9天不同處理后（a）H&E染色（b）Masson染色和（c）IL-6免疫組化染色的代表性明場顯微圖像。（a）中的藍色箭頭表示傷口長度，黑色箭頭表示傷口厚度。（d）在第9天不同治療后用CD31（紅色）和DAPI（藍色）染色后傷口組織新生血管形成的免疫熒光圖像。第9天不同治療組的H&E染色顯示的傷口長度（e）和傷口厚度（f）分析。（g）第9天不同治療組的膠原蛋白體積分數（CVF）。（h）在第9天不同治療組IL-6的陽性細胞數。（i）第9天不同治療的CD31陽性細胞數。每個點表示平均值±SD（n = 7），*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

結論：綜上，研究團隊開發了一種新型且生物相容性良好的益生菌微針貼片，具有長效抗菌作用，可促進感染傷口的愈合。微針貼片為益生菌提供了良好的保護，在4℃下，它在微針貼片內保持高達80%的活力超過60天。插入皮膚后，微針貼片迅速溶解并實現益生菌在深層傷口組織中的快速遞送，益生菌能夠在傷口中存活約一周，并不斷將共同遞送的甘油轉化為抗菌物質，從而在感染的傷口中實現長效抗菌作用。在金黃色葡萄球菌感染傷口的小鼠模型中，與對照組相比，一次施用益生菌微針貼劑在消除有害細菌和促進傷口閉合方面表現出更好的效果，同時減少炎癥、增強組織再生和血管生成，這對慢性感染傷口的治療具有巨大潛力。