流式細胞儀校準方法

1. 流式細胞儀的概述

流式細胞儀由液流系統、光學系統、檢測系統和分析系統四部分組成。測量原理是鞘液和樣品流在噴嘴附近組成個圓柱流束，與水平方向的激光束垂直相交，染色的細胞受激光照射后發出熒光或產生散射光，這些信號分別被光電倍增管熒光檢測器和光電二極管散射光檢測器接收，經過計算機儲存、計算、分析這些數字化信息，就可得到細胞的大小、活性、核酸含量、酶和抗原的性質等物理和生化指標。主要應用于分析細胞內抗原物質、細胞受體、腫瘤細胞的DNA、RNA含量等方面。

2. 術語

等量可溶性熒光分子（MESF）：顆粒發出的熒光信號強度相當的可溶性熒光素分子的物質的量濃度。用于表示顆粒發出的熒光信號強度。

3.流式細胞儀校準

（1）環境條件

室溫為（15~30）℃，室內相對濕度：≤70%。

（2）校準使用標準物質

a.  單一熒光強度的熒光微球標準物質；

b.  多重熒光強度混合熒光微球標準物質；

c.  計數熒光微球標準物質；

d.  淋巴細胞計數標準物質。

注：校準時應采用有證標準物質，相對擴展不確定度不超過20% (k=2)。

（3）校準項目

a.  外觀檢查

b.  分辨力

c.  線性相關系數

d.  檢出限

e.  漂移

f.  重復性

g.  示值誤差

（4）外觀檢查

用目測、手動法進行檢查。

（5）分辨力校準

a.  儀器經預熱，進入正常工作狀態；

b.  在裝有0.5 mL經過0. 22 μm濾膜過濾的磷酸鹽緩沖液的試管中，移取0.5 mL單一熒光強度的熒光微球標準物質，充分混勻后上機實驗；

c.  記錄前向角散射光和488 nm激發下兩個熒光通道，包括綠色熒光（FITC 異硫氰酸熒光素）、橙紅色熒光（PE藻紅蛋白）；

d.  收集門內有效信號10000個，計算前向角散射光和兩個熒光通道中校準微球峰寬的相對標準偏差，即為分辨力。

（6）線性相關系數校準

a.  在裝有1mL經過0.22μm濾膜過濾的磷酸鹽緩沖液的試管中加入20μL多重熒光強度混合熒光微球標準物質，充分混勻后上機實驗；

b.  記錄488 nm激發下綠色熒光（FITC）、橙紅色熒光（PE）通道信號；

c.  對試驗結果進行直方圖分析，熒光強度從低到高至少5種不同的熒光強度峰，每個峰收集10000個門內有效信號，得到每個峰的平均熒光強度；

d.  根據校準微球標準物質證書提供的各個峰的等量可溶性熒光分子（MESF），將各峰的MESF取對數lg（MESF），簡化表示為y，各峰測量的平均熒光強度取對數lg（FITC）或lg（PE），簡化表示為x，將兩者線性回歸得到方程y=kx+b，計算兩個通道的線性相關系數（r）。

（7）檢出限校準

a.  針對綠色熒光（FITC）和橙紅色熒光（PE）熒光通道，采用線性相關系數中得到的線性回歸方程y=kx+b；

b.  計算無熒光標記的空白微球的平均熒光強度值對應的MESF即為熒光檢出限。

（8）漂移校準

a.  將周圍環境溫度控制在允許范圍（設定溫度±3℃）內，在裝有1 mL經過0.22 μm濾膜過濾的磷酸鹽緩沖液的試管中，加入數滴單色熒光微球標準物質，充分混勻后上機試驗；

b.  記錄前向角散射光和488 nm激發下綠色熒光（FITC）、 橙紅色熒光（PE）通道的信號，收集10000個以上門內有效信號；

c.  測試完成后，利用直方圖分析試驗結果，計算標準微球的平均熒光強度值；

d.  連續開機2 h后，在相同流式細胞儀設置和熒光通道電壓值的條件下重復前述試驗步驟，得到標準微球的平均熒光強度值；

e.  計算相對漂移率來表示穩定性。

（9）重復性校準

a.  首先制備取100 μL淋巴細胞標準物質，按比例添加抗原決定簇CD4抗體，輕柔渦旋充分混勻，避光存放半小時，使CD4抗體與細胞充分結合；

b.  將淋巴細胞標準物質標記好CD4抗體后上機測試，收集10000個以上門內有效信號；

c.  重復測量6次，依次記錄每次測量的CD4陽性細胞占總淋巴細胞的百分比，計算CD4陽性細胞數量占總淋巴細胞的百分比的相對標準偏差，作為重復性的評價。

（10）      示值誤差校準

按照測量重復性實驗中得到的CD4陽性細胞占總淋巴細胞的百分比，計算平均值，然后計算示值誤差，最后評估示值誤差校準不確定度。

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