中國.艾本德.eppendorfPCR儀售后維修中心:

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eppendorf-pcr儀反應體系與反應條件標準的PCR反應體系：

①引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。

②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGC好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3’端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。

⑤引物3’端的堿基，特別是末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。

eppendorf-pcr儀 - 工作原理；

類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。

PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時  聚合酶鏈式反應間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈"，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。

 每完成一個循環需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

eppendorf-熒光定量PCR所使用的熒光化學可分為兩種：熒光探針和熒光染料。

現將其原理簡述如下：

熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成*同步。