在高效液相色譜應用的初期，人們認為它會成為氣相色譜的補充方法，然而今天HPLC在藥物分析中幾乎取代了氣相色譜。與其他方法相比，在色譜過程中可能會改變流動極性的液體流動相的應用以及根據所測試物質的特性對流動相進行的所有其他修改，在分離過程中具有很大的優勢。
任何藥物的高效液相色譜 (HPLC) 分析的目的是確認藥物的特性并提供定量結果，以及監測疾病治療的進展。還可以用于通過藥物注冊前調查期間的生物醫學和治療研究，進一步了解人體的正常和疾病過程。生物體液（尤其是血漿、血清或尿液）中藥物和代謝物的分析是高效液相色譜最常見的用途之一。血液、血漿或血清含有十種濃度遠高于分析物濃度的大量內源性化合物。分析物濃度通常很低，對于藥物而言，內源性化合物有時在結構上與待測藥物非常相似。藥物與血漿蛋白的結合也可能發生，這會減少所測量的游離化合物的量。
液相色譜技術對于研究小分子和大分子之間的相互作用非常方便，特別是研究藥物-蛋白質結合。部分研發人員已經使用固定化人血清白蛋白相來研究苯二氮卓類藥物、華法林、布洛芬等藥物的相互作用。使用這個階段作為體內發生的相互作用的模型可以更進一步。通過在流動相中添加藥物，可以研究一種藥物與人血清白蛋白的相互作用如何受到另一種藥物的影響。
液相色譜還廣泛用于對藥物制劑進行的藥物溶出度研究，以評估進入胃時制劑中藥物物質的可用性。將制劑攪拌，溶解浴通常含有旨在模擬胃中條件的水性緩沖液，然后在設定的時間段內對水性緩沖液取樣并分析藥物濃度。藥物穩定性研究至關重要，因為需要避免潛在的有毒降解產物。在此類研究中，有必要證明制劑的藥物含量沒有隨時間變化。此外，如果確實發生降解，則有必要識別和量化降解產物。現階段在很多國家的藥典中都是使用高效液相色譜法代替化學和許多儀器方法來控制藥物。
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