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體外連接法

將外源基因的表達盒亞*到腺基因組的一個片段上,在體外與腺的基因組相連,重新構(gòu)建成一個完整的腺DNA 分子,轉(zhuǎn)染敏感細胞,即可獲得重組腺病毒〔10〕。但腺病毒基因組上適宜于*的酶切位點有限,因而限制了該法的應(yīng)用。目前,可利用該法構(gòu)建全缺失載體。

同源重組法

實驗中常將具有共同或重疊序列的兩種DNA 分子,通過共轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)移到某一生物體內(nèi),在生物體內(nèi)一系列與同源重組有關(guān)的酶的作用下,將DNA 片段由一個DNA 分子(常為含有外源基因的穿梭質(zhì)粒) 轉(zhuǎn)移到另一個分子(常為含有骨架結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒) 中去。生物體不同,構(gòu)建載體的方法各異。在真核細胞中進行同源重組:分為哺乳動物細胞和釀酒酵母細胞兩種。前者常用的為293 和911 細胞,源于人胚腎及人胚成細胞,已整合腺基因,可表達腺E1蛋白,用于增殖E1 區(qū)缺失的腺載體。

構(gòu)建時,需歷經(jīng)篩選及噬斑純化等過程,效率低、費時,且技術(shù)條件要求高。已報道利用釀酒酵母細胞經(jīng)過兩次重組過程將外源基因置換到腺的基因中,與哺乳動物細胞相比,用釀酒酵母細胞構(gòu)建腺載體有一定的*性。例如,可用Southern 雜交技術(shù)直接鑒定酵母細胞*中是否含有腺載體,易于獲得重組的陽性 但重組前要將完整的腺基因組*到酵母人工染色體( YAC) 中,并需要從較大量(至少500 ml) 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的酵母細胞里提取YACs ,重組時,要在擬重組的區(qū)域內(nèi),將腺DNA 分子線性化,由于涉及的DNA 分子較大,做到此點有時也并非易事。

在原核細胞中進行同源重組:所有*的操作,尤其是同源重組的過程可利用大腸埃希菌高效的同源重組機制在工程菌(如BJ5183) 中完成,重組效率高,在轉(zhuǎn)染真核細胞前已完成對載體的鑒定工作,因而避免了反復(fù)鑒定及純化的麻煩,大大縮短生產(chǎn)載體的時間,可在20 d 內(nèi)獲得重組腺〔14 ,15〕。目前,許多實驗室正在利用該法制備重組腺。