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利用近紅外區造影劑和OCT技術：揭示腫瘤內部和腫瘤邊緣淋巴引流
多路徑體內成像對于同時標記不同的分子生物標志物是非常理想的，能夠跟蹤多個細胞的遷移和體內多種分子的運動。通過利用熒光標記技術，活體顯微鏡(IVM)可以在活體動物中同時觀察多種細胞或分子的活動。然而，即使使用多光子顯微鏡，IVM的組織穿透也高達400 μ m，難以應用到許多臨床前和臨床研究。光學相干斷層掃描(OCT)是一種新興的成像方式，允許組織穿透達幾毫米，同時在活體中保持高空間分辨率。然而，由于大多數生物、細胞和生物分子缺乏固有的OCT對比度，傳統的無標簽OCT僅通過檢測成像組織的背散射光來顯示組織解剖結構。越來越需要開發合適的OCT造影劑，來擴大OCT在細胞和分子成像方面的應用，特別是通過多重造影劑的方式。到目前為止，已經研究了相當多的材料作為外源性OCT造影劑，包括微球、微泡、磁性納米顆粒和等離子體納米顆粒。已有研究證明在近紅外一區（NIR-I）使用造影劑進行多重成像的潛力，但由于NIR-I光線穿透率低等。在這項工作中，研究者展示了一類新的OCT金納米造影劑(GNBPs)，具有更窄的等離子體共振峰和更高的光譜靈敏度。通過合成具有不同寬高比和共振峰的GNBP，可以同一動物體內同時顯示多個獨立淋巴液的流動。在黑色素瘤小鼠中，使用GNBPs能夠在體內觀測到腫瘤內部和腫瘤邊緣的淋巴流動，為研究腫瘤細胞的淋巴結轉移提供了重要依據。
GNBP-I和GNBP-II在體外OCT信號對比
使用透射電鏡合成了具有相似的表面形態但尺寸和縱橫比不同的GNBP-I和GNBP-II造影劑，NIR光譜顯示他們的共振峰分別為1225nm和1415nm。使用將帶寬內的OCT干涉圖劃分為兩個子帶的雙波段光譜分析來檢測：波段I(1250-1320nm)和波段II(1321-1400nm)。每個子帶的干涉圖被獨立重建，在光譜域產生兩幅OCT圖像。然后將波段II OCT圖像與波段I OCT圖像相減，得到光譜對比信號。為了測量光譜對比信號強度作為每種GNBP濃度的函數，使用小鼠全血作為參考，在毛細管中以梯度濃度對GNBP-I和GNBP-II進行成像。在重建的光譜OCT b掃描圖像中觀察到水和血液中GNBP-I和GNBP-II的兩種不同的光譜對比信號，采用色調飽和度值(HSV)方案進行彩色編碼。GNBP-I表現出正的光譜對比信號，因為它增強了波段I的散射，但降低了波段II的散射。由于GNBP-II對兩個子波段的響應相反，因此顯示出負的光譜對比信號，但其在波段II的散射比波段I更強。采用離散偶極近似方法模擬了兩種GNBP的散射曲線。隨著濃度的增加，兩種GNBP的OCT光譜對比信號都更強。分析還表明，GNBP-I的光譜對比信號在5 pM至1 nM范圍內隨納米顆粒濃度成比例增加，而GNBP-II的光譜對比信號在5 ~ 100 pM范圍內呈線性增加。當納米顆粒濃度超過500 pM時，可以觀察到GNBP-II的光譜對比信號飽和，計算出GNBP-I和GNBP-II的檢出限分別為3.6和2.8 pM。
GNBP-I和GNBP-II和體內OCT信號隨濃度呈線性相關
在體內實驗中，用聚乙二醇(PEG, MW 5 kDa)對GNBP進行偶聯，以提高其在生物組織中的穩定性和生物相容性。為了驗證GNBP在體內的OCT光譜對比信號，使用兩只不同的小鼠耳中皮下注射不同濃度的PEG-GNBP-I和PEG-GNBP-II，并在每次給藥后立即在每個注射部位用OCT對組織進行成像。為了避免不同注射劑之間的影響，每次注射的體積很小(0.1 μ L)。此外，為防止局部注射的GNBP在成像過程中擴散到鄰近的注射部位,注射距離至少分開1mm。不注射GNBP的小鼠耳組織作為對照，計算GNBP在組織中流動的光譜對比信號，在HSV方案中結合OCT結構、光譜對比和血流信息創建了橫截面復合圖像。隨著注射濃度的增加，兩種GNBP在小鼠耳組織中可以觀察到更強的OCT光譜對比信號。當GNBP-I濃度為5-50 pM，GNBP-II濃度為5-100 pM時，小鼠耳OCT光譜對比信號呈線性增加。
GNBP-I和GNBP-II能同時顯示體內淋巴液的流動
使用PEG-GNBP-1和PEG-GNBP-II同時注射到小鼠耳緣皮下不同位置，在每次注射前后對小鼠耳朵進行OCT掃描并使用雙波段信號處理法生成具有門控的OCT圖像，以顯示小鼠體內血液和淋巴液的光譜對比。注射造影劑前， OCT光譜圖像只顯示血管網絡，該圖像中的光譜對比度信號接近于零(顏色編碼為青色)由于淋巴液是光學透明的，因此在流控圖像中沒有信號。在橫截面復合圖像中，可以看到一條主血管(紅色箭頭表示)和三條淋巴管(黃色箭頭表示)，淋巴管呈現黑色是因為淋巴液產生可忽略的光學反射。在注射GNBP-I后，觀察到除了血流門控OCT光譜圖像上的血管外，還有一個廣泛的管狀網絡，具有高光譜對比度信號。由于他們能夠從間質組織中排出造影劑，表明這些管狀網絡可能是淋巴管。橫斷面復合圖像顯示，所有三條淋巴管均表現出高光譜對比信號(箭頭)，證實了注射后流門控OCT光譜圖像上出現的光譜陽性網絡確實是淋巴管。第一次注射后30分鐘，在耳緣另一個遠端位置皮下注射第二種造影劑PEG-GNBP-II。第二次注射后，部分淋巴管可見負的光譜對比信號。在橫截面復合圖像中，可以在其中一個淋巴管(黃色箭頭)中觀察到負的光譜對比信號。這些連接可能對應于存在于淋巴管室兩端的淋巴閥結構，淋巴管室維持淋巴液的單向流動。
GNBP-I和GNBP-II能夠在腫瘤內部和腫瘤邊緣分別顯示淋巴流動
為了成像腫瘤淋巴引流，先在瘤內注射PEG-GNBP-I，然后在腫瘤周圍的組織皮下注射PEG-GNBP-II。注射前OCT血管造影中可以看到血管生成的腫瘤和瘤周血管。瘤內注射后，由于GNBP-I在整個腫瘤內擴散，整個腫瘤可見陽性的光譜對比信號。從表面流控OCT光譜圖像可以很容易地看到瘤內注射造影劑的淋巴引流路徑。不僅腫瘤近側淋巴管可見陽性光譜對比信號，腫瘤遠側瘤周淋巴管也可見陽性光譜對比信號。與正常淋巴管相比，瘤周淋巴管的平均血管直徑更大，可能是增生造成的。皮下注射PEG-GNBP-II后，觀察到到不僅在瘤周淋巴管，而且在腫瘤內部都可以看到陰性的光譜對比信號，表明GNBP-II已滲入腫瘤淋巴管。橫斷面復合圖像顯示，GNBP-II出現在皮膚表面以下50和160 μ m的淺表和深部腫瘤淋巴管中。淺表淋巴管可能與黑色素瘤周圍真皮組織中的淋巴管相對應。然而，位于皮膚表面以下160 μ m的淋巴管對應于腫瘤淋巴管。皮下注射GNBP-II后，腫瘤下游的瘤周淋巴管主要呈現負的光譜對比信號，可能是由于淋巴管清除導致這些淋巴管中GNBP-I的濃度降低。
GNBPs在黑色素瘤小鼠中追蹤前哨淋巴結
為了進一步研究對比劑注射到兩個不同盆的淋巴引流路徑，在注射前和每次注射后對小鼠耳同側頸深淋巴結進行了成像。注射前橫斷面復合圖像上未見淋巴結淋巴管OCT信號。瘤內注射30分鐘后，淋巴結內淋巴管可見陽性光譜對比信號。皮下注射30分鐘后，在同一淋巴管中可以觀察到陰性的光譜對比信號。結果表明，在瘤內和皮下注射后，GNBPs都被引流到瘤周淋巴管中，然后由頸深淋巴結收集。在對植入黑色素瘤的小鼠進行體內成像后，切除了同側和對側的頸部深部淋巴結，并進行了體外三維(3d)淋巴管造影。在3-D OCT淋巴管光譜圖和橫截面復合圖像中，同側頸淋巴結淋巴管中可見光譜對比信號，但在小鼠對側淋巴結中看不到。同側頸淋巴結的淋巴管網絡和淋巴濾泡在三維光譜增強OCT淋巴管造影中清晰可見。結果表明，使用造影劑GNBPs追蹤了黑色素瘤中的前哨淋巴結。
綜上，研究團隊開發了光譜可識別的OCT造影劑- GNBP，并證明了PEG-GNBP可用于活體動物NIR-II的多重成像。在淋巴研究領域，該技術可用于異質腫瘤細胞的淋巴結轉移成像，也可用于分子成像研究各種淋巴內皮細胞受體在腫瘤血管生成性淋巴管和淋巴結中的動態表達。通過將該技術應用于體內腦成像，相信它可以進一步揭示在神經元炎癥和神經退行性疾病中起重要作用的腦淋巴引流通路的奧秘和復雜性。
