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周細胞收縮是動脈狹窄充血過程中毛細血管收縮的基礎
閱讀：462 發布時間：2022-6-1
冠狀動脈充血階段，狹窄遠端的毛細血管“去募集"（de-recruitment）被認為是發生可逆灌注缺陷和潛在心肌缺血的原因，但潛在機制尚不明確。為探究狹窄條件下充血時，周細胞收縮是否是毛細血管去募集的原因。美國研究人員Carmen Methner等使用雙光子顯微鏡（2PM）和光學顯微血管造影術（OMAG），活體內測量了股動脈狹窄的野生型和周細胞缺失小鼠中，充血引發的毛細血管直徑和灌注變化。結果證明動脈狹窄情況下充血刺激產生的毛細血管收縮與紅細胞流量減少相關，此外充血引發的毛細血管直徑變化優先發生在有周細胞的毛細血管段。進一步使用周細胞部分缺失小鼠模型中證實，動脈狹窄情況下，充血后毛細血管收縮量也顯著低于對照組。這些結果shouci在活體內直接觀察了動脈狹窄遠端由充血引發的毛細血管“去募集"現象，并證明了周細胞收縮這一現象的基礎，對運動性缺血有重要的治療意義。研究成果以“Pericyte constriction underlies capillary de-recruitment during hyperemiain the setting of arterial stenosis"為題發表于Heartand Circulatory Physiology。
背景
在冠狀動脈狹窄情況下，當冠狀動脈灌注壓下降時，動脈自動調節和側支血流會組合維持靜息的毛細血管靜水壓（CHP）和心肌血流。然而運動或藥物引起的充血會在狹窄下游組織中引起可逆的灌注缺陷，特征為毛細血管血容量減少和血管阻力增加。這種現象被稱為毛細血管“去募集"（de-recruitment），充血階段通過動脈狹窄處的血流增加，導致冠狀動脈灌注壓下降，毛細血管去募集似乎可以維持該情況下的CHP，雖然代價是可能有心肌缺血的風險，而目前毛細血管去募集的細胞機制尚不明確。
通常認為毛細血管是血流調節中的被動參與者，因為缺乏可收縮的血管平滑肌細胞。然而對腦和視網膜的研究表明，周細胞（微脈管系統中的收縮性壁細胞）可在毛細血管水平上調節血流。藥物或電刺激周細胞會使毛細血管收縮。此外，周細胞介導的毛細血管直徑變化還參與功能性充血期間腦血流的生理調節，以及實驗性腦缺血后血流的病理性限制。
假設存在動脈狹窄的情況下，充血期間周細胞與毛細血管的去募集有關。由于目前無法以單個細胞分辨率對冠狀動脈微循環進行活體內動態成像，研究人員使用雙光子顯微鏡（2PM）和光學顯微血管造影術（OMAG）對小鼠骨骼肌中的毛細血管去募集進行了直接可視化。使用周細胞表達紅色熒光蛋白的NG2-DsRed轉基因小鼠使周細胞可視化。使用周細胞部分缺失（partial pericyte depletion, PPD）小鼠測試周細胞在毛細血管收縮中的必要性，PPD表型由血小板源生長因子受體β基因中7個點突變產生（PdgfrβF7/F7），導致周細胞退化。
結果
實驗性動脈狹窄模型如圖1A。動脈狹窄導致激光多普勒測得血流瞬間減少，但在3-4min內回到基線水平（圖1B，n = 5）。股動脈局部注射6 mM腺苷制造充血后，對照組血流量增加到約為基線的150%，而存在狹窄的情況下該充血反應被消除（圖1C，n = 5-8；P < 0.001）。這種維持正常靜息血流并*消除充血反應與嚴重動脈狹窄標準相符合。
圖1股動脈實驗性狹窄。（A）骨骼肌圖像，表明狹窄位置（虛線方框）、股動脈（箭頭）和成像位置（虛線圈）。（B）激光多普勒血流儀顯示，股動脈血流在最初的誘導狹窄時降低后，恢復到基線水平。（C）對照組中，腺苷（6mM）使股動脈血流增加，而狹窄情況下該充血應答被消除了。
01-嚴重動脈狹窄情況下，充血會導致毛細血管收縮和去募集
以1min為間隔采集紅細胞血流的OMAG圖像（圖2A），使用血管造影掃描驗證成像位置的穩定。對照組中，充血使紅細胞流量增加（圖2B，對比黑色[基線]與藍色[充血后5min]），而狹窄情況下，充血使紅細胞流量顯著降低（圖2B，對比橙色[基線]與紅色[充血后5min]；每組n = 6-8；P < 0.001）。
通過繪制流量圖像中零值像素的減少或增加（零值表示沒有流量），評估毛細血管的募集或去募集（圖2C）。發現對照組中，充血后紅細胞流量增加，同時零值像素數量減少，提示毛細血管募集（圖2C黑線和藍線；每組n = 6-8；處理與對照的相對比率= 0.966，95% CI= [0.962，0.971]，P < 0.001）。相比之下，狹窄組中充血引發的紅細胞流量下降伴隨著零值像素數量增加，對應腺苷給藥后20min內持續存在的毛細血管去募集（圖2C橙色與紅色；每組n = 6；相對變化率= 1.066，95% CI= [1.017，1.118]，P =0.0080）。
接下來靜脈注射熒光示蹤劑FITC-葡聚糖后，每隔40s使用2PM對血管床成像，評估毛細血管直徑變化。使用IMARIS軟件中的Filaments模塊測量成像框架內所有毛細血管段的直徑（圖2D）。對照組制造充血后，平均毛細血管段直徑短暫增加，但在1-2min內恢復到基線。狹窄組充血引發血管直徑短暫下降，隨后緩慢正?；≒ = 0.04）。充血后前5min內毛細血管直徑變化的分布圖顯示出顯著左移，表明與對照組相比，狹窄組收縮性毛細血管增加（圖2E，P = 0.003）。對照組中，充血使26±5%的毛細血管擴張（直徑增加> 5%），19±3%的毛細血管收縮（直徑減少＞5%）。狹窄組中，充血僅使14±4%的毛細血管擴張，32±4%的毛細血管收縮（圖2E-F；P = 0.049）。
盡管因充血而擴張和收縮的毛細血管段不同（圖2E-F），但動脈狹窄情況下，收縮段數量更多，導致毛細血管網直徑整體減小。因此，紅細胞流量的可視化和整個微血管網絡中毛細血管直徑的直接測量表明，動脈狹窄情況下，充血會導致毛細血管發生去募集，而這主要由毛細血管收縮引起。
圖2 狹窄情況下，充血使毛細血管發生去募集。（A）用于定位的血管造影圖。（B）基線（0min）和腺苷（6mM）處理充血后5min表層毛細血管中的紅細胞流量。實線為每個實驗組動物間的平均計數，點為單個數據。柱形為t=0和5min對照和狹窄組像素計數的平均差。（C）與對照組相比，狹窄組充血后零值像素數量增加，反應了毛細血管去募集。（D）使用2PM在靜脈注射FITC-葡聚糖的NG2-DsRed小鼠中體內評估毛細血管直徑變化。（E）充血后血管直徑變化。（F）充血后收縮擴張比率。
02-毛細血管“去募集"與周細胞相關毛細血管的收縮有關
對骨骼肌微血管床進行可視化（圖3A），根據是否與周細胞胞體相關（圖3B）、是否與周細胞突起相關，或二者都不相關（圖3C）對毛細血管段分類。
使用周細胞收縮劑ATP作陽性對照，以證實使用2PM可以檢測到周細胞收縮。ATP在周細胞相關的毛細血管段中誘發了明顯的收縮（圖3D，n = 10，P = 0.001），但在沒有周細胞關聯的血管中沒有變化（圖3E，n = 10，P = 0.10）。接下來測試狹窄情況下充血后的毛細血管收縮是否與周細胞相關。結果發現狹窄情況下，在有周細胞的毛細血管段中，充血引起收縮數量增加、擴張數量減少（圖3F，n = 12，P = 0.04），但在沒有周細胞的血管段中沒有變化（圖3G，n = 12，P = 0.36）。
圖3存在周細胞的位置發生毛細血管收縮。（A）使用2PM對NG2-DsRed小鼠骨骼肌微血管的活體可視化。以有（B）或無（C）周細胞存在劃分血管段。（D）與鹽水對照相比，局部ATP（1-10mM）處理會使含周細胞的血管段的直徑顯著左移，偏向收縮。（E）缺乏周細胞的毛細血管段并未對ATP做出改變應答。（F）狹窄情況下，充血引發有周細胞的毛細血管段偏向收縮。（G）缺乏周細胞的毛細血管段對充血的反應沒有差異。
03-周細胞缺失阻礙了毛細血管的去募集
使用PPD小鼠確定周細胞在介導毛細血管去募集行為中的作用，DDP是一種轉基因品系，由于Pdgfrβ突變使得周細胞部分但顯著減少。通過PDGFRβ免疫熒光標記識別周細胞、熒光異凝集素B4（isolectin B4）標記血管，證實了PPD小鼠周細胞較少。在PPD小鼠骨骼肌中，與野生型同窩對照相比，帶有PDGFRβ陽性周細胞的、等異凝集素標記的血管結構的覆蓋率減少了45%（圖4A，PPD小鼠中占總血管的37±4%，野生型69±4%，P < 0.001）。
接下來測試PPD和野生同窩對照組小鼠毛細血管的收縮能力。ATP誘導對照中45±4%的毛細血管收縮，PPD組中僅27±4%（圖4B，n = 6-8，P = 0.04），相比減少了約40%。相反，ATP誘導對照組中24±5%的毛細血管擴張，而PPD組顯著增多，為44±6%（n = 6-8，P = 0.02）。已知ATP誘導的毛細血管收縮依賴于周細胞，因此這些結果與PPD 小鼠的周細胞功能相關聯。
動脈狹窄情況下，與對照相比，PPD小鼠充血時收縮毛細血管段的比例顯著降低（圖4C，野生型33±4%，PPD小鼠14±3%，n = 6-8，P 311 = 0.04）。這些發現證實動脈狹窄情況下，周細胞缺失阻礙了毛細血管的去募集。
圖4 周細胞缺失阻止了動脈狹窄情況下的毛細血管去募集。（A）PPD及對照小鼠中，PDGFRβ免疫熒光（紅色）和異凝集素B4標記的毛細血管（綠色）。（B）與對照相比，ATP使PPD小鼠毛細血管應答右移、收縮血管段數量減少。（C）動脈狹窄情況下，PPD小鼠毛細血管對充血的應答右移，偏向擴張，表明收縮血管段數量減少。
結論
本研究直接活體觀察了小鼠骨骼肌在動脈狹窄情況下毛細血管的“去募集"現象，并進一步證明了該現象是周細胞使毛細血管收縮所致。表明周細胞是毛細血管血流量和靜水壓的關鍵調節因子。雖然還存在一些局限性，如使用骨骼肌而不是心臟血管，股動脈床的血液供應與冠狀動脈床有些不同；尚不清楚狹窄情況下，血管對充血的舒縮反應是否由周細胞單獨決定、是否需要內皮細胞參與，這也是后續研究的一個重要方向。本研究的數據依然很有價值，在冠狀動脈缺血治療處理中，阻礙周細胞收縮可作為防止組織損傷的新治療方法。
背景
在冠狀動脈狹窄情況下，當冠狀動脈灌注壓下降時，動脈自動調節和側支血流會組合維持靜息的毛細血管靜水壓（CHP）和心肌血流。然而運動或藥物引起的充血會在狹窄下游組織中引起可逆的灌注缺陷，特征為毛細血管血容量減少和血管阻力增加。這種現象被稱為毛細血管“去募集"（de-recruitment），充血階段通過動脈狹窄處的血流增加，導致冠狀動脈灌注壓下降，毛細血管去募集似乎可以維持該情況下的CHP，雖然代價是可能有心肌缺血的風險，而目前毛細血管去募集的細胞機制尚不明確。
通常認為毛細血管是血流調節中的被動參與者，因為缺乏可收縮的血管平滑肌細胞。然而對腦和視網膜的研究表明，周細胞（微脈管系統中的收縮性壁細胞）可在毛細血管水平上調節血流。藥物或電刺激周細胞會使毛細血管收縮。此外，周細胞介導的毛細血管直徑變化還參與功能性充血期間腦血流的生理調節，以及實驗性腦缺血后血流的病理性限制。
假設存在動脈狹窄的情況下，充血期間周細胞與毛細血管的去募集有關。由于目前無法以單個細胞分辨率對冠狀動脈微循環進行活體內動態成像，研究人員使用雙光子顯微鏡（2PM）和光學顯微血管造影術（OMAG）對小鼠骨骼肌中的毛細血管去募集進行了直接可視化。使用周細胞表達紅色熒光蛋白的NG2-DsRed轉基因小鼠使周細胞可視化。使用周細胞部分缺失（partial pericyte depletion, PPD）小鼠測試周細胞在毛細血管收縮中的必要性，PPD表型由血小板源生長因子受體β基因中7個點突變產生（PdgfrβF7/F7），導致周細胞退化。
結果
實驗性動脈狹窄模型如圖1A。動脈狹窄導致激光多普勒測得血流瞬間減少，但在3-4min內回到基線水平（圖1B，n = 5）。股動脈局部注射6 mM腺苷制造充血后，對照組血流量增加到約為基線的150%，而存在狹窄的情況下該充血反應被消除（圖1C，n = 5-8；P < 0.001）。這種維持正常靜息血流并*消除充血反應與嚴重動脈狹窄標準相符合。
圖1股動脈實驗性狹窄。（A）骨骼肌圖像，表明狹窄位置（虛線方框）、股動脈（箭頭）和成像位置（虛線圈）。（B）激光多普勒血流儀顯示，股動脈血流在最初的誘導狹窄時降低后，恢復到基線水平。（C）對照組中，腺苷（6mM）使股動脈血流增加，而狹窄情況下該充血應答被消除了。
01-嚴重動脈狹窄情況下，充血會導致毛細血管收縮和去募集
以1min為間隔采集紅細胞血流的OMAG圖像（圖2A），使用血管造影掃描驗證成像位置的穩定。對照組中，充血使紅細胞流量增加（圖2B，對比黑色[基線]與藍色[充血后5min]），而狹窄情況下，充血使紅細胞流量顯著降低（圖2B，對比橙色[基線]與紅色[充血后5min]；每組n = 6-8；P < 0.001）。
通過繪制流量圖像中零值像素的減少或增加（零值表示沒有流量），評估毛細血管的募集或去募集（圖2C）。發現對照組中，充血后紅細胞流量增加，同時零值像素數量減少，提示毛細血管募集（圖2C黑線和藍線；每組n = 6-8；處理與對照的相對比率= 0.966，95% CI= [0.962，0.971]，P < 0.001）。相比之下，狹窄組中充血引發的紅細胞流量下降伴隨著零值像素數量增加，對應腺苷給藥后20min內持續存在的毛細血管去募集（圖2C橙色與紅色；每組n = 6；相對變化率= 1.066，95% CI= [1.017，1.118]，P =0.0080）。
接下來靜脈注射熒光示蹤劑FITC-葡聚糖后，每隔40s使用2PM對血管床成像，評估毛細血管直徑變化。使用IMARIS軟件中的Filaments模塊測量成像框架內所有毛細血管段的直徑（圖2D）。對照組制造充血后，平均毛細血管段直徑短暫增加，但在1-2min內恢復到基線。狹窄組充血引發血管直徑短暫下降，隨后緩慢正?；≒ = 0.04）。充血后前5min內毛細血管直徑變化的分布圖顯示出顯著左移，表明與對照組相比，狹窄組收縮性毛細血管增加（圖2E，P = 0.003）。對照組中，充血使26±5%的毛細血管擴張（直徑增加> 5%），19±3%的毛細血管收縮（直徑減少＞5%）。狹窄組中，充血僅使14±4%的毛細血管擴張，32±4%的毛細血管收縮（圖2E-F；P = 0.049）。
盡管因充血而擴張和收縮的毛細血管段不同（圖2E-F），但動脈狹窄情況下，收縮段數量更多，導致毛細血管網直徑整體減小。因此，紅細胞流量的可視化和整個微血管網絡中毛細血管直徑的直接測量表明，動脈狹窄情況下，充血會導致毛細血管發生去募集，而這主要由毛細血管收縮引起。
圖2 狹窄情況下，充血使毛細血管發生去募集。（A）用于定位的血管造影圖。（B）基線（0min）和腺苷（6mM）處理充血后5min表層毛細血管中的紅細胞流量。實線為每個實驗組動物間的平均計數，點為單個數據。柱形為t=0和5min對照和狹窄組像素計數的平均差。（C）與對照組相比，狹窄組充血后零值像素數量增加，反應了毛細血管去募集。（D）使用2PM在靜脈注射FITC-葡聚糖的NG2-DsRed小鼠中體內評估毛細血管直徑變化。（E）充血后血管直徑變化。（F）充血后收縮擴張比率。
02-毛細血管“去募集"與周細胞相關毛細血管的收縮有關
對骨骼肌微血管床進行可視化（圖3A），根據是否與周細胞胞體相關（圖3B）、是否與周細胞突起相關，或二者都不相關（圖3C）對毛細血管段分類。
使用周細胞收縮劑ATP作陽性對照，以證實使用2PM可以檢測到周細胞收縮。ATP在周細胞相關的毛細血管段中誘發了明顯的收縮（圖3D，n = 10，P = 0.001），但在沒有周細胞關聯的血管中沒有變化（圖3E，n = 10，P = 0.10）。接下來測試狹窄情況下充血后的毛細血管收縮是否與周細胞相關。結果發現狹窄情況下，在有周細胞的毛細血管段中，充血引起收縮數量增加、擴張數量減少（圖3F，n = 12，P = 0.04），但在沒有周細胞的血管段中沒有變化（圖3G，n = 12，P = 0.36）。
圖3存在周細胞的位置發生毛細血管收縮。（A）使用2PM對NG2-DsRed小鼠骨骼肌微血管的活體可視化。以有（B）或無（C）周細胞存在劃分血管段。（D）與鹽水對照相比，局部ATP（1-10mM）處理會使含周細胞的血管段的直徑顯著左移，偏向收縮。（E）缺乏周細胞的毛細血管段并未對ATP做出改變應答。（F）狹窄情況下，充血引發有周細胞的毛細血管段偏向收縮。（G）缺乏周細胞的毛細血管段對充血的反應沒有差異。
03-周細胞缺失阻礙了毛細血管的去募集
使用PPD小鼠確定周細胞在介導毛細血管去募集行為中的作用，DDP是一種轉基因品系，由于Pdgfrβ突變使得周細胞部分但顯著減少。通過PDGFRβ免疫熒光標記識別周細胞、熒光異凝集素B4（isolectin B4）標記血管，證實了PPD小鼠周細胞較少。在PPD小鼠骨骼肌中，與野生型同窩對照相比，帶有PDGFRβ陽性周細胞的、等異凝集素標記的血管結構的覆蓋率減少了45%（圖4A，PPD小鼠中占總血管的37±4%，野生型69±4%，P < 0.001）。
接下來測試PPD和野生同窩對照組小鼠毛細血管的收縮能力。ATP誘導對照中45±4%的毛細血管收縮，PPD組中僅27±4%（圖4B，n = 6-8，P = 0.04），相比減少了約40%。相反，ATP誘導對照組中24±5%的毛細血管擴張，而PPD組顯著增多，為44±6%（n = 6-8，P = 0.02）。已知ATP誘導的毛細血管收縮依賴于周細胞，因此這些結果與PPD 小鼠的周細胞功能相關聯。
動脈狹窄情況下，與對照相比，PPD小鼠充血時收縮毛細血管段的比例顯著降低（圖4C，野生型33±4%，PPD小鼠14±3%，n = 6-8，P 311 = 0.04）。這些發現證實動脈狹窄情況下，周細胞缺失阻礙了毛細血管的去募集。
圖4 周細胞缺失阻止了動脈狹窄情況下的毛細血管去募集。（A）PPD及對照小鼠中，PDGFRβ免疫熒光（紅色）和異凝集素B4標記的毛細血管（綠色）。（B）與對照相比，ATP使PPD小鼠毛細血管應答右移、收縮血管段數量減少。（C）動脈狹窄情況下，PPD小鼠毛細血管對充血的應答右移，偏向擴張，表明收縮血管段數量減少。
結論
本研究直接活體觀察了小鼠骨骼肌在動脈狹窄情況下毛細血管的“去募集"現象，并進一步證明了該現象是周細胞使毛細血管收縮所致。表明周細胞是毛細血管血流量和靜水壓的關鍵調節因子。雖然還存在一些局限性，如使用骨骼肌而不是心臟血管，股動脈床的血液供應與冠狀動脈床有些不同；尚不清楚狹窄情況下，血管對充血的舒縮反應是否由周細胞單獨決定、是否需要內皮細胞參與，這也是后續研究的一個重要方向。本研究的數據依然很有價值，在冠狀動脈缺血治療處理中，阻礙周細胞收縮可作為防止組織損傷的新治療方法。
參考文獻：Methner, C. , et al. "Vascular Biology and Microcirculation: Pericyte constriction underlies capillary derecruitment during hyperemia in the setting of arterial stenosis." American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology 317.2.