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利用高光譜受激拉曼散射顯微技術發現人類肝癌中飽和脂肪的異常積聚
閱讀：602 發布時間：2022-6-1
人類癌癥中存在脂質代謝失調現象，傳統觀點認為不飽和脂質的積聚會有利于腫瘤細胞存活和增殖。但目前還沒有成熟的分析工具能夠以高分辨率對未加工人體組織中的代謝物進行識別及定量。來自華中科技大學的Shuai Yan等人使用分析性高光譜激發的拉曼散射顯微術，對24名肝癌患者的正常組織和癌性肝組織中的脂質代謝物進行了原位繪譜。發現與傳統觀點正相反，癌性肝組織中積聚了大量的飽和脂肪，而癌性肝組織周圍的正常組織中幾乎沒有發現這種聚集現象。使用質譜進一步分析發現，癌性肝臟中甘油三棕櫚酸酯含量非常高。這表明飽和脂肪的異常積累很有可能是肝癌的代謝生物標志。該研究以“Hyperspectral Stimulated Raman Scattering Microscopy Unravels AberrantAccumulation of Saturated Fat in Human Liver Cancer“為題發表在Analytical Chemistry。
本文從24名肝細胞癌患者中收集了正常組織和癌性肝組織，并進行高光譜SRS成像，得到飽和脂肪、不飽和脂肪、蛋白質的拉曼圖譜。觀察分析發現與正常肝組織相比，癌性肝組織中飽和脂肪出現大量異常積聚。使用質譜技術進一步研究發現與正常組織相比，癌性肝組織中甘油三棕櫚酸酯(飽和脂肪的一種典型形式)的積累顯著增加。這些發現表明，飽和脂肪在肝癌的發展中起著關鍵作用，可能是肝癌診斷的潛在標志，打破了癌細胞依靠不飽和脂肪生存和增殖的傳統觀點。
圖1b為對應CH區域的自發拉曼光譜：在①2853 cm-1位置TP（深黃色）和TO（綠色）都出現CH2峰；在②2885 cm-1處只有含長直酰基鏈的TP出峰；④3007 cm-1位置為不飽和=CH，TO出峰；BSA在③2935 cm-1處出峰。雖然幾種物質的化學結構之間的差異很細微，但通過不同的拉曼帶可以明顯區分。
研究人員對TP、TO和BSA組成的混合物模進行了高光譜SRS成像，使用多元曲線分辨率(m*riate curve resolution, MCR)算法重建出TP、TO和BSA的空間分布圖(圖1c)，并制作了優化的SRS光譜(圖1d)。得到的SRS光譜保留了所有振動拉曼帶的關鍵特征，包括TP的2885 cm-1 (②)和TO的3007 cm-1 (④)，并與自發拉曼測量的相應光譜非常一致(圖1b)。雖然自發拉曼光譜光譜分辨率更好，因為有高性能光柵且積分時間較長(約10秒)，但高光譜SRS特別適合對生物組織中化學物質進行快速繪圖，能夠通過其內在的化學振動，對復雜生物組織中的飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸進行識別并成像。
驗證了概念可行性后，研究人員從24名肝癌患者中獲得了癌性肝組織及其鄰近正常組織的標本，用超光譜SRS顯微和MCR進行分析檢測，發現了三種含較為量顯著的化學成分。
圖2c-e為主要代謝成分的MCR重建濃度圖，圖2a為彩色重疊圖像，能更好地理解它們的相對空間分布。可直接觀察到有兩種類型的脂肪(黃色和綠色)在癌性肝組織中有顯著積累。圖2c為第一種類型的脂質成分，它以不規則形狀的塊狀和液滴形式存在，對應非常強的拉曼帶并在2885 cm-1處出現峰值，展示出飽和脂肪特征(②)，同時在3007 cm-1 (④)處的去飽和作用曲線平坦，表明反射光譜中沒有=CH振動。圖2d為第二種脂質濃度圖，光譜顯示不飽和脂質特性，在3007 cm-1處有明顯的拉曼帶，主要儲存在細胞內的脂滴中。MCR算法分析出的第三種化學成分為蛋白質，光譜主要在CH3的2935 cm-1處出峰(③品紅色)，且蛋白質在飽和脂肪（圖2c）之外的位置中分布更均勻(圖2e)。
為了更好地理解成分變化，研究人員收集了圖2c、d中五個不同位置的SRS光譜。發現在S1、S2和S3位置，飽和脂肪特點非常突出(圖2f)。其微觀形狀更接近致密的圓形脂滴(圖2c)。但S4和S5位置為飽和脂肪和不飽和脂肪的混合物。同時從形態學上看，其通常具有不規則的形狀，在濃度圖中作為大尺寸的脂質塊存在。在圖2d不飽和脂肪的MCR重建圖像中還發現了不同位置的一定程度的光譜變化。在U1、U2和U3位置，展示出不飽和脂肪的特征(圖2g)。SRS濃度圖中，它們的大小較小，呈規則的圓形，可能是脂滴。然而在U4和U5位置，蛋白質可能在空間上與不飽和脂肪重疊。后續通過計算光譜差異驗證了這一假設。因此可以認為這些是脂質和蛋白質的聚集體，它們也以不規則形狀的斑塊形式出現(圖2d)。
從上述分析結果來看，癌性肝組織中有兩種含量較多的脂質。在脂滴中存在大量的飽和脂肪，而且有些會與不飽和脂質混合在一起。而不飽和脂肪大多伴有細胞內蛋白質。
為從更大面積上證實癌性肝組織確實較正常肝組織儲存了更多的飽和脂肪，研究人員對約500 × 500 μm2大小的癌性組織和正常組織進行了高光譜SRS成像研究。
圖3 癌性肝組織及其周圍正常肝組織的高光譜SRS成像。（a-b）25號患者癌性組織和正常組織的圖像。黃色為飽和脂肪，綠色為不飽和脂肪，品紅色為蛋白質。
圖3a為16幅高光譜SRS圖像及其MCR重建圖像結合生成的大比例尺濃度圖。分析發現在癌組織中飽和脂肪(黃色)廣泛分布，但鄰近的正常肝組織中，飽和脂肪較少(圖3b)。而且正常組織中的肝細胞組織良好，細胞形態清晰。
最后研究人員檢測了24名患者的組織樣本，每個樣本隨機選擇1-3個不同的位置進行SRS成像并通過MCR重建圖像中飽和脂肪的面積進行定量。
圖4a為每個樣本觀察區域的飽和脂肪統計量。可見癌性肝組織中，飽和脂肪的平均面積分數約為12.21%，其中有兩例患者面積分數甚至高達約40%，而在正常肝組織中僅約0.17%，即大多數正常組織檢查部位中沒有觀察到飽和脂肪積聚。隨后研究人員使用質譜儀定量分析了11名患者的癌性肝組織和正常肝組織(圖4b)，測量了包括甘油三棕櫚酸酯(TP，16:0/16:0/16:0)、甘油三油酸酯(TO，18:1/18:1/18:1)和甘油三油酸酯(TL，18:2/18:2/18:2)在內的脂質含量。發現癌性肝組織中的TP含量確實約為正常組織的6倍，正常肝組織中不飽和脂質包括TO和TL的水平也較高。同時在一些患者的正常肝組織中，也觀察到了含有不飽和脂肪的大尺寸脂滴。因為在癌組織和正常肝組織中都觀察到不飽和脂肪，所以不飽和脂肪可能并不是癌組織所*的。而經高光譜SRS成像和大量數據分析都發現，癌性肝組織中的飽和脂肪含量明顯高于正常組織，這表明飽和脂肪很有可能是肝癌代謝生物標志物。
參考文獻：Yan, Shuai , et al. "Hyperspectral Stimulated Raman Scattering Microscopy Unravels Aberrant Accumulation of Saturated Fat in Human Liver Cancer." Analytical Chemistry (2018):6362.
研究背景
本文從24名肝細胞癌患者中收集了正常組織和癌性肝組織，并進行高光譜SRS成像，得到飽和脂肪、不飽和脂肪、蛋白質的拉曼圖譜。觀察分析發現與正常肝組織相比，癌性肝組織中飽和脂肪出現大量異常積聚。使用質譜技術進一步研究發現與正常組織相比，癌性肝組織中甘油三棕櫚酸酯(飽和脂肪的一種典型形式)的積累顯著增加。這些發現表明，飽和脂肪在肝癌的發展中起著關鍵作用，可能是肝癌診斷的潛在標志，打破了癌細胞依靠不飽和脂肪生存和增殖的傳統觀點。
結果與討論
圖1b為對應CH區域的自發拉曼光譜：在①2853 cm-1位置TP（深黃色）和TO（綠色）都出現CH2峰；在②2885 cm-1處只有含長直酰基鏈的TP出峰；④3007 cm-1位置為不飽和=CH，TO出峰；BSA在③2935 cm-1處出峰。雖然幾種物質的化學結構之間的差異很細微，但通過不同的拉曼帶可以明顯區分。
研究人員對TP、TO和BSA組成的混合物模進行了高光譜SRS成像，使用多元曲線分辨率(m*riate curve resolution, MCR)算法重建出TP、TO和BSA的空間分布圖(圖1c)，并制作了優化的SRS光譜(圖1d)。得到的SRS光譜保留了所有振動拉曼帶的關鍵特征，包括TP的2885 cm-1 (②)和TO的3007 cm-1 (④)，并與自發拉曼測量的相應光譜非常一致(圖1b)。雖然自發拉曼光譜光譜分辨率更好，因為有高性能光柵且積分時間較長(約10秒)，但高光譜SRS特別適合對生物組織中化學物質進行快速繪圖，能夠通過其內在的化學振動，對復雜生物組織中的飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸進行識別并成像。
驗證了概念可行性后，研究人員從24名肝癌患者中獲得了癌性肝組織及其鄰近正常組織的標本，用超光譜SRS顯微和MCR進行分析檢測，發現了三種含較為量顯著的化學成分。
圖2c-e為主要代謝成分的MCR重建濃度圖，圖2a為彩色重疊圖像，能更好地理解它們的相對空間分布。可直接觀察到有兩種類型的脂肪(黃色和綠色)在癌性肝組織中有顯著積累。圖2c為第一種類型的脂質成分，它以不規則形狀的塊狀和液滴形式存在，對應非常強的拉曼帶并在2885 cm-1處出現峰值，展示出飽和脂肪特征(②)，同時在3007 cm-1 (④)處的去飽和作用曲線平坦，表明反射光譜中沒有=CH振動。圖2d為第二種脂質濃度圖，光譜顯示不飽和脂質特性，在3007 cm-1處有明顯的拉曼帶，主要儲存在細胞內的脂滴中。MCR算法分析出的第三種化學成分為蛋白質，光譜主要在CH3的2935 cm-1處出峰(③品紅色)，且蛋白質在飽和脂肪（圖2c）之外的位置中分布更均勻(圖2e)。
為了更好地理解成分變化，研究人員收集了圖2c、d中五個不同位置的SRS光譜。發現在S1、S2和S3位置，飽和脂肪特點非常突出(圖2f)。其微觀形狀更接近致密的圓形脂滴(圖2c)。但S4和S5位置為飽和脂肪和不飽和脂肪的混合物。同時從形態學上看，其通常具有不規則的形狀，在濃度圖中作為大尺寸的脂質塊存在。在圖2d不飽和脂肪的MCR重建圖像中還發現了不同位置的一定程度的光譜變化。在U1、U2和U3位置，展示出不飽和脂肪的特征(圖2g)。SRS濃度圖中，它們的大小較小，呈規則的圓形，可能是脂滴。然而在U4和U5位置，蛋白質可能在空間上與不飽和脂肪重疊。后續通過計算光譜差異驗證了這一假設。因此可以認為這些是脂質和蛋白質的聚集體，它們也以不規則形狀的斑塊形式出現(圖2d)。
從上述分析結果來看，癌性肝組織中有兩種含量較多的脂質。在脂滴中存在大量的飽和脂肪，而且有些會與不飽和脂質混合在一起。而不飽和脂肪大多伴有細胞內蛋白質。
為從更大面積上證實癌性肝組織確實較正常肝組織儲存了更多的飽和脂肪，研究人員對約500 × 500 μm2大小的癌性組織和正常組織進行了高光譜SRS成像研究。
圖3 癌性肝組織及其周圍正常肝組織的高光譜SRS成像。（a-b）25號患者癌性組織和正常組織的圖像。黃色為飽和脂肪，綠色為不飽和脂肪，品紅色為蛋白質。
圖3a為16幅高光譜SRS圖像及其MCR重建圖像結合生成的大比例尺濃度圖。分析發現在癌組織中飽和脂肪(黃色)廣泛分布，但鄰近的正常肝組織中，飽和脂肪較少(圖3b)。而且正常組織中的肝細胞組織良好，細胞形態清晰。
最后研究人員檢測了24名患者的組織樣本，每個樣本隨機選擇1-3個不同的位置進行SRS成像并通過MCR重建圖像中飽和脂肪的面積進行定量。
圖4a為每個樣本觀察區域的飽和脂肪統計量。可見癌性肝組織中，飽和脂肪的平均面積分數約為12.21%，其中有兩例患者面積分數甚至高達約40%，而在正常肝組織中僅約0.17%，即大多數正常組織檢查部位中沒有觀察到飽和脂肪積聚。隨后研究人員使用質譜儀定量分析了11名患者的癌性肝組織和正常肝組織(圖4b)，測量了包括甘油三棕櫚酸酯(TP，16:0/16:0/16:0)、甘油三油酸酯(TO，18:1/18:1/18:1)和甘油三油酸酯(TL，18:2/18:2/18:2)在內的脂質含量。發現癌性肝組織中的TP含量確實約為正常組織的6倍，正常肝組織中不飽和脂質包括TO和TL的水平也較高。同時在一些患者的正常肝組織中，也觀察到了含有不飽和脂肪的大尺寸脂滴。因為在癌組織和正常肝組織中都觀察到不飽和脂肪，所以不飽和脂肪可能并不是癌組織所*的。而經高光譜SRS成像和大量數據分析都發現，癌性肝組織中的飽和脂肪含量明顯高于正常組織，這表明飽和脂肪很有可能是肝癌代謝生物標志物。
研究小結
參考文獻：Yan, Shuai , et al. "Hyperspectral Stimulated Raman Scattering Microscopy Unravels Aberrant Accumulation of Saturated Fat in Human Liver Cancer." Analytical Chemistry (2018):6362.
高光譜顯微系統
作為一種新穎的表征手段，高光譜系統正逐漸在多個領域嶄露頭角。IMA高光譜顯微鏡具有優異的光譜和空間分辨率。在掃描樣品光譜的同時繪制圖像。支持明場、暗場成像等多種成像模式，還可以結合拉曼光譜生成空間圖像，滿足不同材料的研究需求。
1.高通量面掃分光系統，能夠更快地獲取數據。包含當前視野范圍內材料的一切光譜信息，可選擇任意波長生成單色圖，也可以選取任意一點抽取光譜。
2.濾光損耗極低(10%)。通過精確控制濾光角度，使成像范圍橫跨數百納米，覆蓋了可見光及近紅外光區，光譜分辨率達5納米以內。
3.全局成像技術——對視野中樣品面掃成像，極大提升了掃描速度。在均勻照明系統的幫助下，能有效減少光源單點聚焦造成的樣品損傷。