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生物制藥設備清潔驗證中復雜化合物的回收率
為表明Sievers* 800總有機碳（TOC）分析儀，對具有高分子量與復雜化學結(jié)構(gòu)的化合物的回收能力，本研究中的這些化合物，通常被認為難于被非燃燒/紅外檢測的TOC儀器氧化并準確檢測。
結(jié)論
Sievers 800 TOC分析儀回收標準溶液中這些化合物的能力非常好。牛血清白蛋白（BSA）、頭孢他啶（CP）、葡聚糖硫酸酯（DS）、牛血紅蛋白（Heme）和人胰島素（HI），以平均95％被回收。本研究為清潔驗證的非專屬但高度靈敏的TOC分析方法提供支持，特別是本案例中的UV/過硫酸鹽方法。此應用具有巨大的價值，因為與其他方法相比，該技術(shù)具有低水平的檢測限（ppb）、分析時間快并且操作成本低。
討論
醫(yī)藥科技協(xié)會（PDA）列出了用于驗證和監(jiān)控清潔的許多合適的物理、化學和生物技術(shù)，其中包括針對特殊分子的試驗以及許多非特定試驗。在查看性能比較和參考之后，PDA特別提到，“典型的清潔驗證研究可使用pH、電導率、總有機碳、洗滌劑試驗，若有多產(chǎn)品設備，則使用產(chǎn)品的試驗。”應比較分析的精度、準確度、檢測限、定量限、選擇性、線性、范圍和靈敏度。進行了許多科學研究以評測性能，比如符合的通用方法：高性能液相色譜（HPLC）、薄層色譜（TLC）、UV光譜、總有機碳（TOC）、酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ELISA）、膠體電泳和電導率等常用方法。藥物殘留、賦形劑、清洗劑殘留和反應副產(chǎn)物都顯示了該方法的優(yōu)點和缺點。
仔細選擇清潔驗證（CV）分析的儀器應是任何清潔驗證主計劃實施的一部分。TOC的使用，應該是僅有的幾種類型 之一，以其氧化方式不同為特點。可使用燃燒爐、加熱的過硫酸鹽溶液或者紫外燈存在下的過硫酸鹽溶液進行氧化。Sievers Model 800使用UV/過硫酸鹽氧化方法，并使用其膜電導測量技術(shù)測定清潔驗證樣品的TOC濃度。
本研究檢驗牛血清白蛋白（BSA）、頭孢他啶（CP）、葡聚糖硫酸酯（DS）、牛血紅蛋白（Heme）和人胰島素（HI）在多種濃度下的回收率。表1所示為回收數(shù)據(jù)一覽表。
表1. 牛血紅蛋白（Heme）、牛血清白蛋白（BSA）、頭孢他啶（CP）、葡聚糖硫酸酯（DS）和人胰島素（HI）
| 化合物 | 理論值［碳］（ppm） | 測定值［碳］（ppm） | %回收率 |
| BSA | 1.00 | 0.910 | 91 |
|
| 2.00 | 1.88 | 94 |
|
| 5.00 | 5.04 | 101 |
|
| 7.50 | 8.16 | 109 |
| CP | 0.50 | 0.498 | 99.6 |
|
| 1.00 | 0.93 | 93 |
|
| 5.00 | 4.30 | 86 |
|
| 10.00 | 8.89 | 88.9 |
|
| 25.0 | 22.1 | 88.4 |
|
| 50.0 | 43.6 | 87.2 |
| DS | 0.60 | 0.744 | 129 |
|
| 1.20 | 1.57 | 131 |
|
| 6.00 | 7.08 | 118 |
| Heme | 0.75 | 0.62 | 82.9 |
|
| 1.50 | 1.33 | 88.9 |
|
| 4.00 | 3.26 | 81.5 |
| HI | 0.0773 | 0.0562 | 73 |
|
| 0.2970 | 0.2420 | 81 |
|
| 0.8480 | 0.6430 | 76 |
|
| 3.2700 | 3.3100 | 101 |
|
| 19.61 | 21.5 | 109 |
所研究化合物的平均回收率為95.9％，范圍在73％至129％之間。化合物回收率很好且在預料之中，然而葡聚糖硫酸酯的回收率范圍在118％至131％之間。 在此研究時，還不清楚這么高回收率的引起原因，但對化合物進行進一步查看，以便找到可能的解釋。值得注意的是，葡聚糖硫酸酯以及其他的所有化合物的回收率線性在濃度范圍內(nèi)非常好。這使得可通過應用相關(guān)的曲線方程方便地預測未知濃度的樣品。圖1是包含各化合物線性的圖，而各公式在表2中。所研究各化合物的線性非常好。
小結(jié)
當進行回收這組生物醫(yī)藥行業(yè)常用的大分子時，Sievers 800 TOC分析儀進行得很好。表明800的UV/過硫酸鹽法可用于將化合物中所含的碳氧化為CO2，進行量化。 許多醫(yī)藥相關(guān)的設備已經(jīng)成為非特定但高靈敏度TOC分析儀用于清潔驗證的很好案例，請注意與其他方法相比，該技術(shù)檢測含量低（ppb）、分析時間快并且成本低，而且可檢測眾多碳基殘留。
表2 BSA、CP、DS、Heme和HI的線性總結(jié)
材料和技術(shù)
試劑
1. 6M的磷酸溶液
在含有1L低TOC水的5L容量瓶中加入2 L 85％的磷酸，并用低TOC水稀釋到體積刻度。
2. 15％過硫酸銨溶液
在5L低TOC水中溶解750 g過硫酸銨。
3. 低TOC水。
材料
1. 牛血清白蛋白（BSA）：Fluka已測定@54.45%碳。
2. 人胰島素（HI）：Fluka已測定@44.1%碳。
3. 頭孢他啶（CP）：SmithKline Beecham已測定@41.5%碳。
4. 葡聚糖硫酸酯（DS）：Aldrich已測定@18.56 %碳。
5. 牛血紅蛋白（Heme）：Aldrich已測定@49.87 %碳。
6. 容量瓶和移液管（使用稀釋的Steris CIP 100™溶液清洗并使用20 次低TOC 水漂洗）。
儀器
1． Sievers 800總有機碳分析儀
2． Sievers TOC 800自動進樣器
參考資料
1. Agalloco J. “Points to consider in the Validation of Equipment Cleaning Procedures,”（設備清潔步驟驗證中的注意點），J. Parenteral Sci. Tech., 46 (5): 163-168, (1992) Cooper D. W., Cleaning Aseptic Fill Areas,. Pharm. Technol. 20(2): 52-60 (1996)
2. Dolch G., Baffi R., Garnick R., Huang Y. F., Mar B., Matsuhiro D., Niepelt B., Parra C., Stephan M., “A Total Organic Carbon Analysis Method for Validating Cleaning Between Products in Biopharmaceutical Manufacturing,”（用于生物醫(yī)藥生產(chǎn)中清潔驗證的總有機分析方法），J. Parenteral Sci. Tech.,45 (1): 13-19, (1991)
3. FDA Guide to Inspections of Validation of Cleaning Processes（清潔驗證步驟檢查的FDA指南），July 1993, p. 8.
4. Godec R., Kosenka P., Hutte R., “Method and Apparatus for the Determination of Dissolved Carbon in Water,”（水中溶解碳測定的方法和器械），U.S. Patent No. 5,132,094 (July 21, 1992)
5. Harder S. W., “The Validation of Cleaning Procedures,”（清潔步驟的驗證），Pharm. Technol., 8 (5), 29-34 (1984)
6. Jenkins K. M., and Vanderweilen A. J., “Cleaning Validation: An Overall Perspective,”（清潔驗證：全面觀察），Pharm. Technol., 18 (4), 60-74, (1994).
7. Parenteral Drug Association, Cleaning and Cleaning Validation: A Biotechnology Perspective（非腸道藥物協(xié)會，清潔和清潔驗證：生物技術(shù)展望），PDA, Bethesda, MD, 1996
8. 
Smith J. M., “Selecting Analytical Methods to Detect Residue from Cleaning Compounds in Validated Process Systems,”（選擇分析方法以檢測來自驗證的工藝系統(tǒng)中清洗化合物的殘留），Pharm. Technol., 17 (6), 88-98 (1993)