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用于 MS 分析的尿蛋白的制備和 HILIC SPE 凈化

該方案描述了使用 MagReSyn® HILIC 進行自下而上蛋白質組學的尿液樣品的高效樣品制備和凈化。

材料：所有試劑和化學品應為分析級或更高級別，最好是 MS 級。

Reagent or Equipment                                                                   Description and catalogue number

MagReSyn® HILIC                                                                          MR-HLC002

Ammonium acetate (NH4Ac)                                                         Fluka A1542-500g

Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)                                            Fluka 40867-50g

Dithiothreitol (DTT)                                                                       VWR 0281-25G

Iodoacetamide (IAA)                                                                     MERCK I1149-25G

Protein LoBind tubes                                                                    Eppendorf 0030108450

Magnetic bead handling station for automated protoco            KingFisher Duo or Flex

Magnetic separator for manual protocol                                    DynaMag™-2 Magnet Catalog number: 12321D

MS grade water                                                                           Pierce™ 51140

Peptide quantification method                                                   Pierce™ Colorimetric (23275) or Fluorometric (23290) Peptide Assay

Adjustable Pipettes

Sodium dodecyl sµlphate (SDS)                                                 MERCK L4509-1Kg

Urea                                                                                            MERCK U5378-1Kg

注意：上面建議的化學品已經過測試，可用于本協議，但也可以使用同等等級的化學品

試劑制備：

DTT Stock: 1M DTT in LCMS grade H2O (prepare fresh)

• IAA Stock: 1M IAA in LCMS grade H2O (prepare fresh, light sensitive)

• Urea sample buffer: 8M urea, 2% SDS (prepare fresh)

• Equilibration Buffer: 15% ACN, 100 mM NH4Ac pH 4.5 (diluted from 1M NH4Ac stock)

• Binding Buffer: 30% ACN, 100 mM NH4Ac pH 4.5

• Wash Buffer: 95% Acetonitrile in LCMS grade H2O

• Trypsin Digestion Buffer: 50mM NH4HCO3 LCMS grade H

注：緩沖液可在 4°C 下保存長達 2 周。

方法：

注意：

該方法是使用 Kingfisher™ 磁性處理站開發和基準測試的。如果您無法使用磁性處理站，您可以遵循下面詳述的協議（手動格式）。 • 建議新鮮制備所有緩沖液。 • 應使用標準采集程序采集尿液樣本。建議收集第一天早上干凈的尿液樣本進行臨床分析。樣品應保存在冰上，直到通過離心處理去除碎片（800 x g，10 分鐘）。如果不立即使用，等分試樣必須儲存在 -80 °C。

尿液制備

1. 在冰上解凍尿液樣本

2. 將 100 µl 尿液轉移至新的 2ml LoBind® Eppendorf 管中。

3. 添加 300 µl 尿素樣品緩沖液并渦旋混合 10 -15 秒。

4. 使用終濃度為 10 mM DTT 在室溫下還原 30 分鐘。

5. 使用最終濃度為 30 mM IAA 的烷基化蛋白質，在室溫下避光 30 分鐘。

6. 通過添加另外 10 mM DTT 來淬滅 IAA

微粒平衡：

7. 通過渦旋混合或翻轉重新懸浮 MagReSyn® HILIC，以確保均勻懸浮液。注意：當制備多個樣品時，請通過定期混合來確保保持均勻的懸浮液，例如在轉移所需體積之前倒置或上下移液微粒混合物。

8. 將 10 µl MagReSyn® HILIC (200 µg) 微粒轉移至 2 ml Protein Lo-Bind 管中。

9. 將管子放在磁力分離器上，等待 5-10 秒，讓微粒澄清。

10. 用移液管吸出運輸溶液并丟棄。

11. 將微粒重懸于 200 µl 平衡緩沖液（參見上文）中，同時攪拌（例如輕輕渦旋混合）15-30 秒，以洗滌微粒。

12. 將管子放在磁力分離器上，讓微粒澄清。

13. 用移液管吸出平衡溶液并丟棄。

14. 重復步驟 12 – 14。注意：只有在準備好添加樣品后，才從微粒中取出第二個平衡溶液（參見下面的步驟 15）。這將確保微粒不會風干，并且在添加樣品時可以輕松地重新懸浮。

樣品結合和清洗：

15. 將（來自步驟 6）還原和烷基化的樣品與 (416 µl) 結合緩沖液（30% ACN，100 mM NH4Ac pH 4.5）以 1:1 (v/v) 比例混合。

16. 轉移尿素樣品緩沖液 - 將緩沖液混合物與步驟 14 中的平衡微粒結合。注意：如果自動化工作流程，請參閱儀器的體積參數，以確保凈化的兼容性。

17. 在室溫下孵育 30 分鐘并持續混合（例如緩慢渦旋）以確保樣品和微粒充分相互作用。

18. 將管子放在磁力分離器上，讓微粒澄清。用移液器抽吸除去并丟棄未結合的部分。

19. 用 200 µl 洗滌緩沖液洗滌微粒，并輕輕攪拌混合 60 秒。可選：可以將微粒混合物轉移到新的 2ml Protein Lo-Bind 管中，以確保留在管側壁上的污染物在后續消化步驟中不會重新引入樣品中。

20. 將管放在磁力分離器上，并允許 5 -10 秒清除微粒。除去上清液并丟棄。 21. 重復步驟 19 和 20 中描述的清洗步驟。

珠上蛋白質消化：

22. 通過添加 200 µl 50 mM 碳酸氫銨 pH 8.0（含有 1 µg 測序級胰蛋白酶（酶：蛋白質比例 1:30））進行珠上消化，并在 47 °C 下孵育 2 小時。確保充分混合以使顆粒在消化過程中保持在溶液中。可選：還可以將 0.25 µg 測序級 LysC 添加到消化緩沖液中以改善消化。

23. 將管子放在磁力分離器上，等待 5-10 秒，讓微粒澄清。

24. 取出肽溶液并放入 0.5 ml Eppendorf LoBind 管中。可選：為了提高肽回收率，可以將微粒與 50 至 100 µl 1% TFA 一起孵育 5 分鐘，同時混合，然后將上清液與步驟 29 中的消化溶液合并。

25. 對樣品進行真空或冷凍干燥并重懸于 20-40 µl LCMS 溶劑中，例如2% ACN 和 0.2% 甲酸

26. 進行比色肽測定以確定肽回收率并調整 LC-MSMS 分析的負載。可選：可以使用比色測定來評估 HILIC 方法去除 SDS 的效率，該比色測定可以測量肽存在下的 SDS 一致性，例如 Arand、Friedberg 和 Oesch，1992 年中描述的方法。

27. 通過 LC-MSMS 分析消化物。注：如果使用不帶陷阱洗脫選項的納米 LCMS 設置，建議使用標準 C18 脫鹽工作流程進一步對消化液脫鹽

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