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圖1。AT101引起 MPNST 細胞中半胱天冬酶非依賴性的非凋亡性細胞死亡。 AT101處理的細胞表現(xiàn)出濃度和時間依賴性的活力降低(A，B)。AT101處理在 ST88-14細胞中引起濃度依賴性細胞毒性(C)。細胞活力的喪失不伴隨著半胱天冬酶 -3樣酶活性的增加(D) ，BAF 廣泛的半胱天冬酶抑制不能保護 AT101誘導(dǎo)的細胞死亡(E)。AT101(15μM，24小時)處理不增加 T265-2c 細胞中的膜聯(lián)蛋白 V 染色(F)。以星形孢素(STS)為陽性對照，誘導(dǎo)半胱天冬酶 -3樣活性、膜聯(lián)蛋白 V 染色和半胱天冬酶依賴性細胞凋亡。* p-value < 0.05.# = 不顯著，p 值 > 0.05。

由(-)-棉酚誘導(dǎo)的癌細胞死亡可以由半胱天冬酶依賴性或半胱天冬酶非依賴性機制引起[24] ，[29]。為了確定 AT101是否觸發(fā) MPNST 細胞中的效應(yīng)半胱天冬酶活化，在裂解后在 AT101處理的細胞中測量活性效應(yīng)半胱天冬酶(半胱天冬酶 -3,6和7)的藥理學(xué)底物 devD-AMC 的切割。我們發(fā)現(xiàn) AT101處理對 T265-2c 和 ST88-14細胞中半胱天冬酶 -3樣的酶活性沒有影響(圖1D)。與這些結(jié)果一致，用廣譜半胱天冬酶抑制劑 BAF 預(yù)處理不減弱 T265-2c 和 ST88-14細胞中 AT101誘導(dǎo)的細胞毒性，與其抑制星形孢菌素誘導(dǎo)的這些細胞死亡的能力相反(圖1E)。為了進一步確定 AT101誘導(dǎo)的 MPNST 細胞死亡是否為凋亡，我們通過流式細胞術(shù)測定了處理的 T265-2c 細胞中膜聯(lián)蛋白 V 和碘化丙啶染色。AT101處理不增加膜聯(lián)蛋白 V 陽性細胞而增加碘化丙啶陽性細胞(圖1F)。基于這些發(fā)現(xiàn)，我們得出結(jié)論，AT101通過半胱天冬酶依賴性凋亡以外的機制導(dǎo)致 MPNST 細胞死亡。在 MPNST 細胞死亡過程中 AT101觸發(fā)的自噬不具有細胞保護作用

-)-棉酚先前已經(jīng)顯示在其他癌癥類型中刺激自噬[30] ，[31]。然而，細胞保護作用和細胞毒作用都歸因于(-)-棉酚誘導(dǎo)的癌細胞自噬[24] ，[31]。因此，我們首先詢問 AT101是否也刺激 MPNST 細胞的自噬。對 AT101處理的細胞的全細胞裂解物進行免疫印跡并探測 LC3 II 水平的變化，LC3 II 是一種被廣泛接受的自噬空泡(AVs)的替代標志物[32]。與未經(jīng)處理的對照組相比，AT101處理的細胞 LC3 II 的穩(wěn)態(tài)水平顯著增加(圖2A)。我們通過進行免疫細胞化學(xué)來證實這一觀察結(jié)果，這表明 AT101處理改變了 LC3樣免疫反應(yīng)性的細胞內(nèi)分布，從相對較弱的彌散染色模式到與 T265-2c 細胞中增強的 AV 含量一致的強點狀模式(圖2B)。

圖2。AT101誘導(dǎo)的 MPNST 細胞自噬不具有細胞保護作用。用 AT101處理導(dǎo)致 MPNST 細胞中 LC3-II 穩(wěn)態(tài)水平的濃度依賴性增加(A)和指示 AV 積累的點狀 LC3樣免疫染色模式(B)。AT101引起 MPNST 細胞中自噬通量的增加，如用 AT101(10μM，24小時)和 BafA1(100nM，收集裂解物前4小時加入)處理的細胞中 LC3 II 水平的增加所證明的與單獨的藥物(C)相比。用3-甲基腺嘌呤(用 AT101處理前1小時3MA-5mM)處理的 T265-2c 細胞顯示 LC3-II 積累水平降低(D)和 AT101(15μM，24小時)誘導(dǎo)的細胞死亡(E)。比例尺 = 20微米。* p-value < 0.05.

雖然 LC3 II 水平的增加表明 AV 的積累，這可以反映增加的自噬誘導(dǎo)和/或減少 AV 降解。因此，我們評估了在存在或不存在 Bafilomycin A1(BafA1)(一種阻斷 AV 降解的液泡 ATP 酶抑制劑)的情況下用 AT101處理的 MPNST 細胞中的自噬通量[33]。我們觀察到，與單獨使用兩種藥物相比，用 AT101和 BafA1處理的細胞中 LC3 II 水平增加，表明 AT101刺激房室形成(圖2C)。為了評估 AT101誘導(dǎo)的自噬在 MPNST 細胞中的功能作用，我們通過在暴露于 AT101之前用3-甲基腺嘌呤(3MA)(圖2D)處理細胞來抑制 AV 形成。3MA 是一種 III 類磷脂酰肌醇3-激酶的抑制劑，這是啟動自噬所必需的[34] ，[35]。我們發(fā)現(xiàn)3MA 對自噬的藥理學(xué)抑制導(dǎo)致了 AT101誘導(dǎo)的 T265-2c 細胞死亡的適度但有統(tǒng)計學(xué)意義的減弱(圖2E)。這些發(fā)現(xiàn)表明，AT101誘導(dǎo)的 MPNST 細胞自噬不具有細胞保護作用，并且可能發(fā)揮細胞毒性作用。 BNIP3介導(dǎo) MPNST 細胞中 AT101誘導(dǎo)的細胞死亡 BNIP3是參與細胞死亡，自噬和線粒體清除的非典型 BH3-only 蛋白[36]。BNIP3可以介導(dǎo)非凋亡形式的細胞死亡，這是半胱天冬酶獨立的，并與誘導(dǎo)自噬有關(guān)，響應(yīng)于一些刺激[37]-[39]。這些觀察結(jié)果使我們假設(shè) BNIP3介導(dǎo) AT101刺激的 MPNST 細胞死亡。

我們首先詢問在用5-20μMAT101處理24小時的 MPNST 細胞中 BNIP3蛋白水平是否增加。全細胞裂解物的免疫印跡分析表明，AT101處理以濃度依賴性方式增加 BNIP3蛋白的水平(圖3A)。免疫細胞化學(xué)同樣顯示在 AT101處理的 MPNST 細胞中 BNIP3樣免疫反應(yīng)性增加(圖3B)。為了確定 BNIP3蛋白的增加是否與 mRNA 的相應(yīng)增加相關(guān)，我們使用定量實時 PCR 來評估用 AT101處理后 MPNST 細胞中 BNIP3 mRNA 的穩(wěn)態(tài)水平。我們發(fā)現(xiàn)，與未處理的 MPNST 細胞相比，AT101處理導(dǎo)致 BNIP3 mRNA 水平顯著增加(圖3C)。

圖3。BNIP3調(diào)節(jié) MPNST 細胞中 AT101誘導(dǎo)的細胞毒性。 AT101處理的 MPNST 細胞在蛋白質(zhì)印跡(A)和免疫細胞化學(xué)(B)上顯示 BNIP3蛋白的濃度依賴性增加。與未處理的細胞相比，AT101處理導(dǎo)致 MPNST 細胞中 BNIP3 mRNA 的顯著增加(C)。AT101(10μM，24小時)不顯著改變 T265-2c 細胞中 BCL-2，BCL-xL，BIM，PUMA 和 BECLIN1蛋白水平的表達(D)。用針對 BNIP3的 siRNA 轉(zhuǎn)染的 T265-2c 細胞在用 AT101(E)處理后顯示 BNIP3蛋白水平(相對于 GAPDH 的比率)顯著降低，并且相對于用非靶 siRNA 轉(zhuǎn)染的細胞顯著保護免于 AT101誘導(dǎo)的細胞死亡(F)。比例尺 = 20微米。* p-value < 0.05.

由于(-)-棉酚已被報道影響一些 BCL-2家族成員的蛋白質(zhì)水平，我們檢測了 AT101處理后 T265-2c 細胞中 BCL-2，BCL-xL，BIM，PUMA 和 BECLIN1的水平。我們發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)的水平在很大程度上不受 AT101處理的影響(圖3D)。