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cytoskeleton運動蛋白質常見問題
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運動蛋白資源目錄
運動蛋白質類
真核驅動蛋白運動蛋白利用ATP水解的能量沿著細胞骨架微管網絡移動貨物，如染色體和小泡[1]。它們在細胞內運輸的幾乎所有方面都發揮著重要作用，并參與廣泛的生理過程，包括胚胎發育[2]、軸突運輸[3]和細胞分裂[4]。。。（點擊此處了解更多關于運動蛋白的信息）。
運動蛋白質常見問題
問題1：如何使用驅動蛋白進行藥物篩選？
答案1：動蛋白運動蛋白利用微管（MT）作為底物，在細胞內協調各種動力學事件。它們已經被證明可以沿著MT軌道運送染色體和血管等貨物。驅動蛋白通過水解利用ATP的能量來發揮作用，這種活性在MT存在的情況下會大大增強。為了篩選調節運動蛋白和MT之間相互作用的藥物，MT激活的驅動蛋白ATP酶測定可以用作驅動蛋白的MT激活的ATP酶活性的測試。細胞骨架開發了兩種這樣的測定法，一種是終點測定法，另一種是動力學測定法，可用于發現和優化驅動蛋白調節劑。兩種測定都測量由微管激活的驅動蛋白三磷酸腺苷（ATP酶）活性產生的無機磷酸鹽（Pi）水平。這兩種驅動蛋白-ATP酶生物化學分析試劑盒（Cat.#BK053和BK060）提供MT和驅動蛋白重鏈（KHC）蛋白以及必要的緩沖液和試劑，以測量Pi的產生，作為篩選調節驅動蛋白和/或MT功能相互作用的藥物的手段。這些試劑盒可用于發現驅動蛋白抑制劑和激活劑（Cat.#BK053和BK060）以及測定驅動蛋白運動蛋白的Vmax和Kcat值（Cat.#BK060。
問題2：有哪些試劑盒可用于表征推定的運動蛋白？
答案2：運動蛋白利用微管作為底物，這意味著運動蛋白是微管相關蛋白（MAP）的一種類型。為了證實推定的運動蛋白與微管結合，可獲得Cytoskeley的微管結合蛋白旋轉下降測定試劑盒（Cat.#BK029）。待評估的蛋白質需要通過考馬斯藍或銀染色或用蛋白質本身的抗體或與蛋白質綴合的標簽（his、myc等）進行可視化。不可水解的ATP類似物，例如AMPPNP，通常以5或10mM使用以維持微管附著。微管還激活運動蛋白的ATP酶活性，這可以用我們的驅動蛋白ATP酶測定法之一（Cat.#BK053或BK060）來測量。這些試劑盒可用于發現驅動蛋白抑制劑和激活劑（Cat.#BK053和BK060）以及測定驅動蛋白運動蛋白的Vmax和Kcat值（Cat.#BK060。Cytoshelle，股份有限公司還提供Biochem試劑盒（Cat.#BK027），其允許使用熒光標記的微管可視化運動蛋白運動。
技術支持
時間：周一至周五，山地標準時間上午8點至下午5點
Cytoskeley的技術服務團隊提供無與比的服務和支持，讓您與擁有開發和測試我們在現場實驗室創建的分析、試劑盒和試劑第一手經驗的科學家取得聯系。您可以上述號碼致電我們的技術服務小組，或通過上述電子郵件地址以電子方式提交您的問題。問題通常會在一個工作日內通過電話或電子郵件回復。還請務必查看我們的常見問題解答、技術提示和其他產品信息，這些信息可以通過產品類別或目錄號訪問。
運動蛋白質
Cytoskeley Motor-Werks™（CMW）產品線由Cytoskelle家生產和銷售。這些產品促進了運動蛋白領域的研究和藥物發現的進展（Funk等人，2005）。我們專注于生產高純度和生物活性的真核生物和真菌來源的驅動蛋白和肌球蛋白家族蛋白。這些試劑用于抗有絲分裂藥物的發現和運動活性的機制研究。Cytoskeley Motor-Werks™生產線還包含幾種Biochem試劑盒™、抗體和其他與運動相關的試劑（如微管穩定劑紫醇，Cat.#TXD01）和蛋白質（如預形成的微管，Cat.#MT002）。
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概述
真核驅動蛋白運動蛋白利用ATP水解的能量沿著細胞骨架微管網絡移動貨物，如染色體和小泡[1]。它們在細胞內運輸的幾乎所有方面都發揮著重要作用，并參與廣泛的生理過程，包括胚胎發育[2]、軸突運輸[3]和細胞分裂[4]。許多驅動蛋白在細胞分裂中的重要作用，以及驅動蛋白的過度表達與視網膜母細胞瘤等癌癥有關[5]，使它們成為抗有絲分裂癥發展的非常有吸引力的靶點。觀察到許多驅動蛋白僅在細胞分裂過程中表達，這也表明它們可能優于目前的抗有絲分裂藥物靶點，如普遍表達的微管蛋白[6，7]。
Kinesins的一般結構
所有驅動蛋白的標志是存在一個保守的~340個氨基酸的運動結構域[8]。這個領域分為兩個主要部分。第一部分是催化核心區，由催化ATP水解的ATP結合位點[9]和將馬達束縛在MT軌道上的微管（MT）結合位點[10]組成。第二部分是約10-40個氨基酸的頸部區域，被認為有助于單向運動[11]。在球狀運動結構域之外，存在一個α-螺旋卷曲螺旋區，參與蛋白質的同源和異源寡聚，最常見的是以同源二聚體的形式存在。這個區域被稱為莖[8]。柄通常將運動域與稱為尾部的第二個球狀域分開。尾部域被認為與貨物綁定有關。
Kinesin分類與結構多樣性
迄今為止，從酵母（釀酒酵母含有6種驅動蛋白）、真菌到人類（目前有13種驅動肽[12]），已經在生物體中鑒定出約150種驅動素。分類基于運動域同源性，特別是在特定類別的頸部和鄰近區域[12]。目前人們一致認為驅動蛋白至少有九類[12，13，14]。如表1所示。命名法（表1中以粗體顯示）基于運動蛋白結構域在驅動蛋白中的位置，因此N-蛋白在蛋白的氨基末端含有運動結構域，而C-和M-運動蛋白分別位于蛋白的羧基末端和中間[12]。
Cytoskeley提供的重組驅動蛋白已被設計為結合運動結構域，包括頸部區域和大部分柄結構域，這些構建體被設計為產生正常的二聚體結構，盡管這尚未通過沉淀分析進行測試。在給定類別的驅動蛋白中，約340個氨基酸的運動區的同源性可以在N-1類（最高度保守的囊泡運輸運動）的74-81%同一性和C類（最發散的）的46-50%同一性之間變化[13]。類之間的同一性百分比下降到35-40%[13]左右。對現有運動數據的結構比較表明，不同驅動蛋白類別的運動之間存在顯著的構象變異，結構差異集中在六個區域，其中大多數在微管結合或將核心運動與柄區連接方面具有重要的功能[9，11]。考慮到不同驅動蛋白類別的馬達之間相對較高的百分比差異，很可能會確定類別特異性驅動蛋白藥物。這一結構證據得到了生物化學數據的支持，這些數據表明，不同種類的果蠅驅動蛋白對各種ATP類似物的利用不同[15]。考慮到ATP結合口袋是運動結構域中最高度保守的區域之一，這一點令人印象深刻[9]。這些實驗表明，即使在給定的物種內，驅動蛋白類別之間也存在明顯的結構差異，可以用于選擇性藥物開發。在這方面，令人鼓舞的是，我們已經能夠在HTS測定中檢測驅動蛋白之間的類似物特異性（見I期報告）。因此，我們相信，我們將能夠檢測出具有潛在抗癌藥物用途的類特異性化合物。
*大膽的分類系統取自Hirokawa[12]。括號中的分類系統在文獻中經常使用，取自Moore和Endow[14]。
**An，巢狀曲霉：Hs，智人：Dm，黑腹果蠅。
黃色/綠色陰影表示僅在細胞分裂中起作用的驅動蛋白類別，淺黃色陰影表示包含在細胞分裂或有絲分裂中起功能的驅動素類別，未陰影區域表示僅參與囊泡運輸的驅動肽。
尋找潛在的抗真菌藥物需要我們識別一類驅動蛋白內的結構變化，如上所述，運動區域在任何給定類別的驅動蛋白中的變化都小于類別之間的變化。在這方面有兩點值得注意；首先，我們的主要真菌靶標是BimC蛋白，它屬于最多樣化的驅動蛋白類，在運動區內表現出約47%的同一性（任何低于60%的同一度都被認為是可接受的差異靶標特異性），其次，我們在重組蛋白靶標中包括了高度可變的柄區（見實驗方法），它提供了相對蛋白質特異性的靶標（<20%同一性）[13]。重要的是，對柄區的抗體抑制已被證明可抑制體內運動功能[16]。
用于HTS測定的Kinesin靶點的選擇
驅動蛋白的細胞功能可分為兩大類；膜囊泡和細胞器的運輸和定位，以及有絲分裂紡錘體的形態發生和染色體運動[12]。一類驅動蛋白在功能上有許多相似之處，這并不奇怪。從表1中可以看出，九類驅動蛋白運動中有四類專門參與細胞分裂（表1的黃色/綠色陰影區域），兩類（C-和M-）同時含有囊泡轉運蛋白和有絲分裂運動（表1中的淺黃色陰影區域）；三類（N-I、NIII和N-IV）專門參與囊泡轉運（表1未陰影區域）。
我們從每一類驅動蛋白[6，17，21，22，26，28，29，30，39]中選擇了一種人類同源物，并從人類病原體曲霉菌中選擇了兩種真菌驅動蛋白[34]，作為HTS測定的基礎（如表1所示）。通過用化合物文庫篩選每種蛋白質，可以生成一個初級數據庫，該數據庫將允許鑒定選擇性靶向細胞分裂特異性類人驅動蛋白的化合物（表1的深色陰影區域），同時對囊泡運輸驅動蛋白沒有影響。這類化合物最有可能是治療人類疾病如癌癥的有效抗有絲分裂劑。同樣，與驅動素曲霉菌特異性反應的化合物可以作為潛在的抗真菌藥物進行研究。
Kinesins作為有效的抗有絲分裂靶點
在開始一項昂貴的藥物發現計劃之前，必須嚴格評估所提出的蛋白質是否符合有效藥物靶點的標準。驅動蛋白將成為抗有絲分裂藥物開發的優秀靶點的證據來自一系列實驗方法，包括突變分析[40]、抗體抑制實驗[7，32]和驅動蛋白活性的反義抑制[19]。表1總結了這一證據，其中可以看出，對給定的有絲分裂特異性驅動蛋白的功能性抑制導致細胞分裂的抑制。例如，通過向HeLa細胞中微量注射抗-Eg5抗體對HsEg5的體內抑制導致>80%的細胞停止有絲分裂。使用過表達的HsEg5運動結構域突變體證實了這些結果[7]。在另一組實驗中，人類細胞系中無運動CENP-E蛋白的體內過表達導致染色體在中期板上排列失敗，并導致有絲分裂阻滯[22]。此外，向HeLa細胞微量注射CENP-E抗體也會導致持續4至17小時的有絲分裂阻滯，并導致所有細胞進入凋亡[22]。由于這兩種蛋白質都包含在我們的HTS測定中，我們非常希望針對這些馬達的化合物具有治療相關性。有趣的是，N-V類驅動蛋白（表1）含有與視網膜母細胞瘤有關的人類驅動蛋白[5]。這種運動的非洲爪蟾同源物的反義和抗體抑制導致有絲分裂阻滯和細胞死亡[19]這一事實令人鼓舞，表明靶向人類促色蛋白的藥物可能在治療/預防視網膜母細胞瘤方面有用。
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