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細(xì)胞馴化懸浮細(xì)胞株

（CHO-K1）

細(xì)胞名稱：CHO-K1倉鼠卵巢細(xì)胞亞株

描述：該細(xì)胞株是源自成年中國倉鼠卵巢深入活體組織切片的CHO細(xì)胞的亞克隆。

動物種別：中國倉鼠  雌

組織來源：卵巢

形態(tài)：上皮細(xì)胞

細(xì)胞馴化前的培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件：F12K培養(yǎng)基(SIGMA,貨號N3520，添加NaHCO3 2.5g/L)，90%；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%。 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度。

含量：>1x10⁶ 細(xì)胞數(shù)

規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

用途：僅供科研使用。

細(xì)胞株馴化：

復(fù)蘇CHO-K1細(xì)胞轉(zhuǎn)入T25 cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶，以F12K基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加10%血清培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿單層后，加入 0.25 % 胰蛋白酶消化，傳代至裝有完培的T25 cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶（Corning）中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底時，即得貼壁 CHO-K1 細(xì)胞。取貼壁CHO-K1 細(xì)胞，換液，加入15 mL含血清的完培和 15 mL無血清CHO-K1專用培養(yǎng)基，2天后吸出一半培養(yǎng)液，加入等量的無血清CHO-K1，每2天重復(fù)一次此操作，直到胎牛血清濃度低于 1 %后，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基B001 繼續(xù)培養(yǎng)，即培養(yǎng)基中血清濃度依次以 5 %，2 .5 %，1.25%，0.625 %，0 %降低。細(xì)胞在無血清CHO-K1專用培養(yǎng)基中密度達(dá)到5 ×10⁶cells/ mL時，即得懸浮 CHO-K1 細(xì)胞。培養(yǎng)條件：37℃，5 % CO₂培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

運輸和保存：干冰運輸及復(fù)蘇好存活細(xì)胞：（1）1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。（2）T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作。

細(xì)胞接收后的處理：

1） 收到細(xì)胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染，請拍照后及時聯(lián)系我們。

2）請在4或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)，同時給剛收到的細(xì)胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時收到時細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。

3） 懸浮細(xì)胞：T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，然后抽出瓶中的培養(yǎng)基和細(xì)胞1000rpm離心5分鐘，棄去上清重懸后接種到新的培養(yǎng)瓶中（加入按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的完培）。

4）備注：運輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞，請換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的完培來培養(yǎng)細(xì)胞。 收到細(xì)胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代 。

細(xì)胞培養(yǎng)步驟：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1）準(zhǔn)備： CHO GROW CD2 培養(yǎng)基98 %    GlutaMAX-1谷氨酰胺1%，P/S青霉素-鏈霉素 1%

2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90% CHO-K1專用培養(yǎng)基，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二．細(xì)胞處理：

1）  凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：：

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完培的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完培重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml完培的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞密度。

2）  細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

注：第一次傳代推薦傳代比例為1:2，以后傳代比例可根據(jù)客戶需要自己決定。

方法一：收集細(xì)胞，1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

細(xì)胞凍存，收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實驗使用。下面T25瓶為例；

3）細(xì)胞凍存: 收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實驗使用。下面T25瓶為例；

1. 細(xì)胞凍存時按照細(xì)胞傳代的過程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計數(shù)板計數(shù)，來決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×10⁶ ~ 1×10⁷個活細(xì)胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞 ，按每1ml凍存液含1×10⁶ ~ 1×10⁷個活細(xì)胞/ml分配到一個凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

3. 將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。

注意事項：

1. 所有動物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內(nèi)操作，并請注意防護(hù)，所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

2. 建議在復(fù)蘇凍存細(xì)胞時始終使用防護(hù)手套、衣服和戴上防護(hù)面罩。注意：凍存管浸沒在液氮中會泄漏，并會慢慢充滿液氮。解凍時，液氮轉(zhuǎn)化成氣相可能導(dǎo)致容器爆炸或用危險力吹掉其蓋子，從而產(chǎn)生飛揚的碎屑造成人員傷害。