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人胚腎細胞(293T)

細胞介紹

細胞持續表達SV40抗原，該細胞常用于轉染實驗，轉染效率較高。（轉染一般以50%密度鋪板，待細胞剛剛貼到皿壁上后（一般8-10小時），即可進行轉染操作）

細胞特性

1）  來源：人胚胎腎臟

2）  形態：上皮細胞樣，貼壁生長，貼壁能力較弱

3）  含量：>1x106  細胞數

4）  規格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5）  用途：僅供科研使用。

運輸和保存：干冰運輸及復蘇好存活細胞：（1）1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉入液氮或直接復蘇，若發現干冰已揮發干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯系。（2）T25瓶復蘇的存活細胞常溫發貨，收到后按照細胞接收后的處理方法操作。

細胞接收后的處理：

1）收到細胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養箱放置約2-3h，若發現培養瓶破損、有液溢出及細胞有污染，請拍照后及時聯系我們。

2）請在4或5X顯微鏡下確認細胞狀態，同時給剛收到的細胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養瓶外觀照片一張留存，作為售后時收到時細胞狀態的依據。

3）半貼細胞和貼壁不牢（懸浮）細胞：T25瓶置于37℃培養箱中約2-3h，顯微鏡下觀察細胞的情況，若細胞密度在60%以下，客戶需收集T25瓶中的懸浮細胞離心后用完培重懸后打回到原培養瓶中繼續培養，若細胞生長70%-90%對細胞進行傳代，傳代時需要收集培養基中懸浮的細胞離心后回收。

4）備注：運輸用的培養基（灌液培養基）不能再用來培養細胞，請換用按照說明書細胞培養條件新配制的完培來培養細胞。  收到細胞后第一次傳代建議T25培養瓶1：2傳代 。

一．培養基及培養凍存條件準備：

1） 準備DMEM（培養基；優質胎牛血清，10%；L-谷氨酰胺（2mM）1%；NEAA  1% ； 雙抗 1%

注意：1.該細胞貼壁能力較弱，培養時可酌情使用預鋪0.2%明膠的培養瓶/培養皿。完培養液中需添加熱滅活胎牛血清。細胞生長不能過密，過密細胞容易脫落，脫落下來的細胞可以通過離心收集，使用0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA 消化后繼續培養。

2.如果發生293T細胞不貼壁，漂浮在培養基中的現象，請確認所使用的DMEM中碳酸氫鈉濃度及培養箱中CO2濃度。并參考以下培養體系：

a) DMEM由1.5 g/L碳酸氫鈉配制而成，使用5％CO2培養箱。

b) DMEM由3.7 g/L碳酸氫鈉配制而成，使用10％CO2培養箱。

當使用碳酸氫鈉含量高的培養基時，必須將這些細胞在10％CO2中孵育，以便正確緩沖培養基。當培養基沒有適當緩沖時，239T細胞雖然可以存活，但將無法粘附并保持漂浮在培養基中。

2） 培養條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%FBS，10%DMSO，現用現配。

二． 細胞處理：

1）凍存細胞的復蘇：

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完培的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完培重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml完培的培養瓶（或皿）中37℃培養過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達70%-90%，即可進行傳代培養。

該細胞為懸浮和輕微的貼壁細胞，傳代可以參考以下方法：

1. 收集：將培養瓶中的懸浮的細胞收集到離心管中。用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。由于細胞貼壁不牢PBS潤洗后細胞會脫落所以PBS也要回收到離心管中。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）置于37℃培養箱中消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養基來終止消化。

3. 將收集到的懸浮細胞、pbs清洗液中的細胞和消化下來的貼壁細胞以1000rpml離心5min，棄去上清，補加1-2mL培養液后重懸混勻后將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完培以保持細胞的生長活力，后續傳代根據實際情況按1:2~1:5的比例進行。

3） 細胞凍存: 收到細胞后建議在培養前3代時凍存一批細胞種子以備后續實驗使用。下面T25瓶為例；

1. 細胞凍存時按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中，可使用血球計數板計數，來決定細胞的凍存密度。一般細胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個活細胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細胞凍存液重懸細胞 ，按每1ml凍存液含1×106~1×107個活細胞/ml分配到一個凍存管中將細胞分配到凍存管中，標注好名稱、代數、日期等信息。

3. 將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續查閱和使用。

注意事項：

1. 所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內操作，并請注意防護，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

2. 建議在復蘇凍存細胞時始終使用防護手套、衣服和戴上防護面罩。注意：凍存管浸沒在液氮中會泄漏，并會慢慢充滿液氮。解凍時，液氮轉化成氣相可能導致容器爆炸或用危險力吹掉其蓋子，從而產生飛揚的碎屑造成人員傷害。