蛋白質藥物的PEG化學修飾（NH2-PEG-MAL NHS-PEG-SH）
蛋白質的PEG修飾主要包括：蛋白質分子的側鏈基團的改變和蛋白質分子中主鏈結構的改變二個方向。關于側鏈基團修飾的研究較多。化學修飾反應的活性和選擇性主要由蛋白質功能基的反應活性及修飾劑的反應活性決定[5]。其中蛋白質功能基的活性由微區極性和空阻效應決定。修飾劑的反應活性主要取決于修飾劑分子中官能團的類型。
我們可以用于蛋白修飾的PEG有化學法修飾方法，目前常用的有三種基團修飾，PEG修飾的基團主要是氨基如（MAL-PEG-NH2）、巰基如（HS-PEG-COOH）、羧基如（COOH-PEG-OH）等。下面我們主要介紹這三種修飾方法：
方法1：氨基法修飾蛋白(NH2-PEG)
可能用的到的產品：
NH2-PEG-COOH
NH2-PEG-MAL
NH2-PEG-N3
NH2-PEG-Alkyne
NH2-PEG-SH
NH2-PEG-Biotin
NH2-PEG-OPSS
NH2-PEG-OH
蛋白質分子表面的游離氨基(主要為Lys殘基側鏈的氨基)具有較高的親核反應活性。因此Lys殘基的氨基成為方便,常用的被修飾基團。PEG的分子量大多為5kD。目前常用的活化劑有氰尿酰氯(亦稱三聚氯氰)(見圖1)和N-羥基琥珀酰亞胺(見圖2)。
(1)氰尿酰氯法特點是試劑易得、活化簡單、反應時間短、方便經濟。但其對有些酶(例如:SOD)的活性有影響。這種活化中間物有兩種形式:一種是一分子氰尿酰氯與一分子PEG偶聯(PEG1);另一種是一分子氰尿酞氯與兩分子PEG偶聯(PEG2)。通常PEG2修飾的蛋白質效果要更好。它可以在較低的修飾程度下獲得解除免疫原性產物,而且生物活性保留明顯高于PEG1修飾的產物。(2)在pH=7～ 9條件下,PEG的N-羥基琥珀酰亞胺酯類化合物可以直接修飾殘基上的氨基。將PEG上的羥基轉化為羧基,其中常用的是通過羥基與琥珀酸酐反應,
所得衍生物化合物為PEG琥珀酰亞胺琥珀酸酯[6]。此外,N-末端氨基修飾也是一種常用的修飾方法。蛋白質N端氨基的pKa(7.6～8.0),小于蛋白質其他部位的氨基(如賴氨酸的pKa為10.0～10.2)。因此,在較低pH值(如pH 5.0)溶液中,PEG-醛主要與N-端氨基反應生產希夫堿,后被還原為仲胺。
方法2：巰基修飾（PEG-SH/Thiol）
可能用的到的產品：
HS-PEG-NHS
Biotin-PEG-SH
CHO-PEG-SH
Hydrazide-PEG-SH
Silane-peg-SH
Acrylates-peg-SH
Lipoicacid-peg-SH
Tosylate-peg-SH
蛋白質上的修飾基團多為親核性的,其活性的順序是:巰基>α -氨基>ε -氨基>羥基。所以可以選取能夠特異性PEG修飾劑對數目巰基進行定向修飾。此類PEG修飾劑主要有:
(1)PEG-馬來酰亞胺(PEG-maleimide)
NHS-PEG-MAL
N3-PEG-MAL
Alkyne-PEG-MAL
Biotin-PEG-MAL
CHO-PEG-MAL
OPSS-PEG-MAL
(2) P E G- 鄰- 吡啶- 二硫醚( P E G -ortho-pyr idyl-disulphide) ;
Hydrazide-PEG-OPSS
Silane-peg-OPSS
Acrylates-peg-OPSS
Lipoic acid-peg-OPSS
Tosylate-peg-OPSS
Acetylthio-peg-OPSS
Aminooxy-PEG-OPSS
NPC-PEG-OPSS
SAS-PEG-OPSS
SC-PEG-OPSS
SCM-PEG-OPSS
SG-PEG-OPSS
SS-PEG-OPSS
(3)PEG-乙烯基砜(PEG-vinyl sulfone);
(4)PEG-碘乙酰胺(PEG-idoacetamide)。
其中,PEG-馬來酰亞胺應用較多。但產物在水中不夠穩定,容易發生開環反應。Winslow[7]等在PEG與馬來酰亞胺之間添加芳香環作連接基團,并用來修飾血紅蛋白質,取得了更佳的修飾專一性。對于缺少巰基的蛋白質,可以通過基因工程在蛋白質的合適位置引入巰基,再用相應PEG進行修飾。常用的引入位置有糖基化蛋白質的糖基化位置、蛋白質的抗原決定簇和蛋白質末端等。此外,還可用Traut試劑處理蛋白質引入巰基。此方法方便可靠,目前應用為廣泛。但缺點是半胱氨酸在蛋白質內多為重要活性基團。因此這樣修飾有可能影響活性。
方法3：羧基的修飾
把PEG分子中的羥基轉化為氨基,然后在羧二亞胺存在下與蛋白質的羧基縮合,得到修飾的蛋白質(見圖4)。對蛋白質進行修飾時,關鍵是修飾劑的選擇和修飾路線的確定。修飾路線的確定,要考慮使修飾蛋白質能大限度地保留原來生物活性,要能使其免疫原性降至小程度,甚至*解除,其中修飾度的確定非常重要。修飾劑的選擇要考慮其結構與性質,還要考慮其分子量大小。所以這兩方面的選擇是很重要的。
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