Protein G aMagnetic Beads蛋白G磁珠公司正在出售的產(chǎn)品：人甲狀腺癌細(xì)胞　促腎上腺皮質(zhì)釋放激受體2封閉多肽　禽腺病毒PCR檢測(cè)試劑盒　大鼠抗雙鏈DNA抗體/天然DNA抗體(dsDNA) 試劑盒 ELISA　氨N去甲基化（AND）活性比色法檢測(cè)試劑盒　麥根腐平臍蠕孢　FAM50B蛋白抗體

商品屬性：

Protein G Magnetic Beads 是大小均勻，具有分散度的，表面共價(jià)綴合超純（純度>97％）的重組蛋白 G 的二氧化硅基質(zhì)超順磁珠。這種磁珠是經(jīng)過(guò)專門設(shè)計(jì)，并經(jīng)過(guò)嚴(yán)格質(zhì)量管理檢測(cè)的，主要用于當(dāng)使用的一級(jí)抗體確定時(shí)，用于免疫沉淀和細(xì)胞分選。 同時(shí)，也被廣泛用于從血清樣品，腹水，血漿或組織培養(yǎng)上清中快速和有效的一步純化多個(gè)種類的IgG 蛋白。表1總結(jié)了本磁珠的結(jié)合親和力和特異性。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

·適用于快捷，簡(jiǎn)便的一步高通量程序;無(wú)需純化柱或過(guò)濾器，或者重復(fù)的移液或離心(Fig.1) ·由于磁珠的親水性表面，非特異性結(jié)合率極低

·結(jié)合容量

·對(duì)樣本體積要求低，便于自動(dòng)化操作

·性價(jià)比高

產(chǎn)品屬性：

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緩沖液成分：

·.Protein G Beads (懸浮在 10 mM Tris, 0.15 M NaCl, 0.1% BSA,1 mM EDTA, pH7.4, 0.1% NaN3 緩沖液中) ·1x Protein G Binding/Washing Buffer (57.7 mM Na2HPO4,42.3 mM NaH2PO4, pH 7.0) ·1x Protein G Elution Buffer (0.2 M Glycine/HCl,pH 2.5) ·1x Protein G Neutralization Buffer (1.0 M Tris-HCl, pH 9.0)

所需耗材：

磁力分離器（適用于手動(dòng)操作）：根據(jù)實(shí)驗(yàn)時(shí)生物樣品的體積，使用者可以選擇以下不同型號(hào)的磁力分離器：8 孔磁力架可以容納 8 個(gè)單獨(dú)的 1.5-2.0 ml離心管; 24 孔磁力架可以容納 24 個(gè)單獨(dú)的 1.5-2.0 ml 離心管; 4 孔磁力-15 可以容納4 個(gè)單獨(dú)的15ml 離心管; 4 孔磁力架-50 可以容納四個(gè)單獨(dú)的 50 ml 離心管。

操作過(guò)程: 此過(guò)程可被等比例放大或縮小

提示：

1. 該方案是經(jīng)過(guò)優(yōu)化的，可用于純化來(lái)自不同來(lái)源的大多數(shù)IgG抗體。然而， 由于沒(méi)有兩種抗體相同，因此不可能為所有IgG純化設(shè)計(jì)一個(gè)通用試劑 盒。為了獲得最佳結(jié)果，每個(gè)用戶必須根據(jù)故障排除部分中的建議，確定純 化單個(gè)抗體時(shí)的最佳工作條件，尤其是弱結(jié)合抗體（見(jiàn)表1）。

2. 為確保離子強(qiáng)度和pH值的最佳結(jié)合條件，有必要在純化前用Binding/ Washingbuffer按照至少1:1比例稀釋血清樣品、腹水或組織培養(yǎng)物。通 過(guò)離心或 0.2μ m過(guò)濾器過(guò)濾，去除樣品中的任何不溶性物質(zhì)。

3. 在純化IgG之前，用戶應(yīng)將試劑盒中包含的所有試劑平衡至室溫。

PCR基本步驟及注意事項(xiàng)？

一、實(shí)驗(yàn)原理

PCR是體外人工選擇性擴(kuò)增DNA的一種方法，它類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計(jì)的特定序列，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定位置的擴(kuò)增；PCR Buffer提供一個(gè)反應(yīng)的緩沖環(huán)境；反應(yīng)過(guò)程同生物體內(nèi)一樣，DNA雙鏈打開，引物結(jié)合模板，延伸形成新鏈。而這些過(guò)程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過(guò)控制反應(yīng)溫度實(shí)現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結(jié)合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復(fù)重復(fù)此過(guò)程即可實(shí)現(xiàn)對(duì)特定片段DNA的大量擴(kuò)增。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來(lái)呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)期(Plateau)會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng)， 減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物，cDNA等，但不能為RNA。對(duì)于不同類型的模板，其主要不同在于預(yù)變性的時(shí)間以及模板的量。一般對(duì)于大的基因組DNA預(yù)變性時(shí)間10min足夠，質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過(guò)在第一輪循環(huán)時(shí)只有一個(gè)引物結(jié)合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個(gè)引物均與特異位點(diǎn)結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增，原因就在于實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶，只能特意識(shí)別DNA鏈。

2.對(duì)于模版的量來(lái)說(shuō)，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對(duì)于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^(guò)大對(duì)PCR造成影響，故需對(duì)提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過(guò)高則可能會(huì)引起非特異性擴(kuò)增。對(duì)于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，且提取濃度一般較低，則無(wú)需稀釋。

PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意的問(wèn)題有哪些?

沒(méi)有ct值

檢測(cè)結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問(wèn)題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過(guò)45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));

2、PCR程序設(shè)置錯(cuò)誤,檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸時(shí)采集信號(hào),另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解。可通過(guò)PAGE電泳檢測(cè)引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過(guò)500ng,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書即可), 對(duì)未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲(chǔ)備,避免反復(fù)凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴(kuò)增基因組DNA;上下游引物Tm值超過(guò)4℃以上也會(huì)影響擴(kuò)增)。

ct值過(guò)晚

在相對(duì)定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對(duì)定量中, 對(duì)低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會(huì)增大, 但是一般不宜超過(guò)40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過(guò)晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行。

1、擴(kuò)增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計(jì)不合理, 需要重新設(shè)計(jì);

2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時(shí)間短(可以在推薦的時(shí)間條件下延長(zhǎng)10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長(zhǎng)。PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過(guò)500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測(cè)或?qū)⒛０暹M(jìn)行稀釋。

公司正在出售的產(chǎn)品：