RTS BL21(DE3)Chaprone助溶表達感受態(tài)公司正在出售的產(chǎn)品：豚鼠肺成纖維細胞　EIF1AD蛋白封閉多肽　產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌型PCR檢測試劑盒　大鼠嗜性粒細胞陽離子蛋白(ECP)ELISA試劑盒　肉桂醇脫氫（CAD)活性比色法檢測試劑盒　紅色糖多孢菌　21號染色體開放閱讀框56抗體

商品屬性：

描述：BL21(DE3) Chaprone 感受態(tài)細胞中含有分子伴侶蛋 白質(zhì)粒，其表達產(chǎn)物可協(xié)助重組蛋白正確折疊形成可溶活性 蛋白。分子伴侶蛋白質(zhì)粒為抗性（chloramphenicol， Cmr）的表達受控于四環(huán)素（tetR）操縱子，因此該感受態(tài) 不適用于抗性表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。 本品使用  的化學(xué)感受態(tài)技術(shù)制備， 其室溫可保存 3 天、-20°C 可保存 2 年（推薦保存溫度）、 -80°C 可長期保存性能無下降。運輸過程中無需干冰，可常 規(guī)冰袋運輸（推薦運輸溫度）。該感受態(tài)細胞為熱激感受態(tài) 細胞，轉(zhuǎn)用于蛋白表達（不可用于克隆和載體構(gòu)建），經(jīng) 42°C 熱激 1min 可獲得 105～106 cfu/μg 效價，可滿足質(zhì)粒轉(zhuǎn)化要 求。該制品使用簡單、運輸、儲存方便。 

組分
RTS BL21(DE3)Chaprone Competent Cell（10T） 1 瓶
Nano E.coli Transfection Reagent 1 mL
儲存：RTS 系列感受態(tài)為干粉形式，均可室溫保存 3 天，長期保存-20°C（2 年）。經(jīng) Nano E.coli Transfection Reagent溶解后的感受態(tài)必須分裝后，并于-60°C 以下保存。溶解后的感受態(tài)細胞避免反復(fù)凍融，在-60°C 以下可保存 6 個月。
操作方法
1. 從-20°C 冰箱中取出 Nano E.coli Transfection Reagent融化，放置于冰上。取 300 μl Nano E.coli TransfectionReagent 加入到一支凍干感受態(tài)細胞中，并分裝到 10 支 1.5ml EP 管中（每支 30 μl），于-60°C 以下保存（或立即使用）。
2. 將 10～100 ng 質(zhì)粒 DNA（不可使用連接產(chǎn)物、不可使用篩選標(biāo)記質(zhì)粒）加入到分裝的感受態(tài)細胞中，輕彈EP 管（或槍頭輕輕吹打），置于冰上 15min。
3. 置于 42°C 熱激 1 min 后，迅速置于冰上急冷 2 min。
4. 熱激完畢后，向上述感受態(tài)細胞中加入 450 μL 不含抗生素的 SOC（或 LB）培養(yǎng)基，37 °C 振蕩（225 rpm）培養(yǎng)60 min。使質(zhì)粒上抗性標(biāo)記基因表達，菌體復(fù)蘇。
5. 取200 μl復(fù)蘇菌液涂布到含相應(yīng)抗生素的LB瓊脂平板表面。（含相應(yīng)質(zhì)粒抗生素和 20 μg/ml ）
6. 將平板置于 37 °C 培養(yǎng)，12~18 小時后可出現(xiàn)菌落。
7. 挑選生長良好的菌落，接入 LB 培養(yǎng)基（含相應(yīng)質(zhì)?？股兀?0 μg/ml），37 ℃劇烈振蕩培養(yǎng)過夜。
8. 1/50 比例接入新的 LB 培養(yǎng)基（含相應(yīng)質(zhì)?？股?，20μg/ml ，0.5 mg/ml L-阿拉伯糖）37 ℃劇烈振蕩培養(yǎng)至菌體密度 OD600 約 0.3（約 2h）。
9. 加入終濃度 2 ng/ml 四環(huán)素（誘導(dǎo) chaprone 伴侶蛋白表達），37℃劇烈振蕩培養(yǎng)至 OD600 約 0.5（約 2~4h）。
10. 加入適量 IPTG(0.1-1 mM), 15℃振蕩培養(yǎng) 24h（培養(yǎng)搖床無法制冷條件下，室溫誘導(dǎo) 8～12h）。
11. 4,000 rpm 室溫離心 15 min，收集細胞，進行蛋白表達和可溶性表達分析。

PCR基本步驟及注意事項？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法，它類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計的特定序列，實現(xiàn)對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應(yīng)的緩沖環(huán)境；反應(yīng)過程同生物體內(nèi)一樣，DNA雙鏈打開，引物結(jié)合模板，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應(yīng)溫度實現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結(jié)合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復(fù)重復(fù)此過程即可實現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應(yīng)。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴增，達到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺期前結(jié)束反應(yīng)， 減少非特異性產(chǎn)物。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物，cDNA等，但不能為RNA。對于不同類型的模板，其主要不同在于預(yù)變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預(yù)變性時間10min足夠，質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結(jié)合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結(jié)合，從而實現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增，原因就在于實現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡單，且提取濃度一般較低，則無需稀釋。

PCR實驗中應(yīng)該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));

2、PCR程序設(shè)置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復(fù)凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實驗設(shè)計和目的進行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計不合理, 需要重新設(shè)計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長。PCR產(chǎn)物設(shè)計超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或?qū)⒛０暹M行稀釋。

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