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逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）實驗詳解
閱讀：163 發布時間：2024-10-21逆轉錄-聚合酶鏈反應 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。
實驗步驟:
一、總RNA的提取
總RNA提取可以：（1）獲得高純度、高質量的總RNA；（2）可以滿足生物學下游實驗Northern Blot、核酸酶保護實驗、RT-PCR、qRT-PCR 和陣列分析所需。
二、cDNA第一鏈的合成
目前試劑公司有多種cDNA第一鏈試劑盒出售，其原理基本相同，但操作步驟不一。現以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 試劑盒為例。
1． 在0.5 ml微量離心管中，加入總RNA 1-5 μg，補充適量的DEPC H2O使總體積達11 μl。在管中加10 μM Oligo（dT）12-18 1 μl，輕輕混勻、離心；
2．70℃加熱10min，立即將微量離心管插入冰浴中至少1min；
3． 取0.5 ml PCR管，依次加入下列試劑：第一鏈cDNA 2 μl；上游引物（10 pM） 2 μl；下游引物（10 pM） 2 μl；dNTP(2mM) 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl） 1 μl。輕輕混勻，離心。42℃孵育2-5 min；
4．加入SuperscriptⅡ1 μl ，在42℃水浴中孵育50 min；
5． 于70℃加熱15 min以終止反應；
6．將管插入冰中，加入RNase H 1 μl ，37℃孵育20 min，降解殘留的RNA。-20℃保存備用。
三、PCR
1．取0.5 ml PCR管，依次加入下列試劑：第一鏈cDNA 2 μl；上游引物（10 pM）2 μl；下游引物（10 pM）2 μl；dNTP(2 mM) 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl）1 μl；
2．加入適量的ddH2O，使總體積達50 μl。輕輕混勻，離心；
3．設定PCR程序。在適當的溫度參數下擴增28-32個循環。為了保證實驗結果的可靠與準確，可在PCR擴增目的基因時，加入一對內參（如G3PD）的特異性引物，同時擴增內參DNA，作為對照；
4．電泳鑒定：行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果；
5．密度掃描、結果分析：采用凝膠圖像分析系統，對電泳條帶進行密度掃描。
注意事項:
1．在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂；
2． 為了防止非特異性擴增，必須設陰性對照；
3．內參的設定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差；
4． PCR不能進入平臺期，出現平臺效應與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結構以及目標DNA起始的數量有關。故對于每一個目標序列出現平臺效應的循環數，均應通過單獨實驗來確定；
5． 防止DNA的污染： 采用DNA酶處理RNA； 在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。
其他:
1．反轉錄酶的選擇
（1） Money 鼠白血病病毒（MMLV）反轉錄酶：有強的聚合酶活性，RNA酶H活性相對較弱。最適作用溫度為37℃；
（2）禽成髓細胞瘤病毒（AMV）反轉錄酶：有強的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適作用溫度為42℃；
（3）Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩定性反轉錄酶：在Mn2+存在下，允許高溫反轉錄RNA，以消除RNA模板的二級結構；
（4）MMLV反轉錄酶的RNase H-突變體：商品名為Superscript 和SuperScriptⅡ。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉換成cDNA，這一特性允許從含二級結構的、低溫反轉錄很困難的mRNA模板合成較長cDNA。
2．合成cDNA引物的選擇
（1） 隨機六聚體引物：當特定mRNA由于含有使反轉錄酶終止的序列而難于拷貝其全長序列時，可采用隨機六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA。用此種方法時，體系中所有RNA分子全部充當了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。
（2） Oligo(dT)：是一種對mRNA特異的方法。因絕大多數真核細胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物與其配對，僅mRNA可被轉錄。由于Poly(A+)RNA僅占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機六聚體作為引物和得到的cDNA在數量和復雜性方面均要小。
（3）特異性引物：最特異的引發方法是用含目標RNA的互補序列的寡核苷酸作為引物，若PCR反應用二種特異性引物，第一條鏈的合成可由與mRNA 3’端最靠近的配對引物起始。用此類引物僅產生所需要的cDNA，導致更為特異的PCR擴增。