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蛋白質純化膠體過濾法步驟
閱讀：714 發(fā)布時間：2023-8-28 不同大小的蛋白質分子進入膠體過濾管柱，可依其分子量差異分離；是一種廣泛應用的partition色析法（Pharmacia操作手冊，GelFiltration）。
儀器設備：色析管柱（PharmaciaCcolumn,1.6×100cm）、鐵架、鐵夾及水平儀；部分收集器（fractioncollector,需準備干凈試管約100支）；濃縮用離心機（低速5,000rpm）；濃縮用離心管Centriprep-30（Amicon4322）請注意其使用方法
藥品試劑：膠體SephacrylS-300（Pharmacia）：a.預先以緩沖液bufferA-150平衡好，并且使wan全沈降后的膠體體積，占全部體積的七至八成；要先預估好膠體的使用量。b.膠體溫度要與操作場所的溫度一致，否則溫度變化會產(chǎn)生氣泡。c.Sephacryl系列膠體有相當大的吸附力，因此要在緩沖液加入0.15M以上的NaCl以除去非專一性吸附。BufferA-150:注意使用時的溫度要與管柱膠體的溫度一致標準分子量組合（Bio-Rad151-1901）：溶于1mL后每組取0.4mL.含有thyroglobulin（670kD），bovinegammaglobulin（158kD），chickenovalbumin（44kD），equinemyoglobin（17kD），vitaminB12（1,350）
方法步驟：
1、管柱裝填：
1）、以純水沖洗玻璃管柱（以純水上下沖洗即可，嚴禁使用試管刷）；并請了解管柱的構造與拆裝方法，垂直架好管柱，以軟管連接部分收集器，并以bufferA-150試看管路是否通暢；可以用止血鉗或長尾文書夾夾住出口軟管，則可控制溶離的進行。注意系統(tǒng)的擺設要適當，不要裝置于交通要沖。
2）、依預估量取出Sephacryl膠體，注意膠體的溫度與緩沖液是否已平衡；將瓶中的膠體上下震蕩，使的wan全懸浮，但勿產(chǎn)生太多氣泡。
3）、在管柱內(nèi)加入約10cm高緩沖液，然后將膠體慢慢沿著管壁倒入管柱，一直加到管柱頂端，開始流洗后膠體沈降很快。當膠體上方的液面逐漸降低時，可于頂端添加膠體，以達所要高度；膠體高度約90cm.
4）、膠體wan全沈降后，小心以bufferA-150加滿管柱，關閉出口，裝上頂端端蓋并連通緩沖液瓶，打開出口以重力流洗。調整緩沖液瓶高度，使流速約每五~六秒一滴，并設定收集體積為2.5mL/tube.
5）、膠柱流洗約100mL后，關閉出口，拆開頂端端蓋，先以滴管吸出膠體上方的溶液到剩約1cm高，注意勿破壞膠體表面平整；然后打開出口，使液面下降至膠體面，再關閉出口，準備注入樣本。
二、 樣本色析進行：
6）、以微量移液器或滴管吸取樣本（樣本體積不得超過膠體總體積的3%），沿著膠體上方管壁緩慢加入，注意切勿破壞膠體的平整表面！（樣本確實體積_______mL）
7）、打開出口，同時開啟部分收集器；當樣本wan全沒入膠體時，關閉出口，緩緩加入與樣本相等體積的bufferA-150,打開出口待其慢慢進入膠體中，如此重復二次。不得擾動膠體表面，造成凹陷。
8）、暫時關閉出口，將液面高度加滿至管柱頂端，并把頂端端蓋鎖上；然后打開出口開始溶離，調整緩沖液瓶的高度，使流速為6s一滴。
9）、要留心觀察前面幾個分劃，確定整個系統(tǒng)運轉無礙，小心部分收集器最容易出問題。管柱預計將流洗過夜，收集約80管。
10）、收集試管，進行蛋白質定量分析以及GUS活性測定，并請作圖。
11）、收集GUS活性區(qū)，以Centriprep-30濃縮至10mL后，加bufferA-0稀釋至20mL,再次濃縮至_______mL（GF），保留100μL.
12）、管柱請再以bufferA-150流洗100mL后，小心放置一旁，準備以后進行分子量測定。
三、分子量測定：
13）、進行分子量測定前一天，請先以bufferA-150流洗100mL，并檢查膠柱內(nèi)有無氣泡產(chǎn)生，若有嚴重的氣泡或干裂，必須重新裝填管柱。
14）、取標準分子量溶液0.4mL,加上純質目標酶0.5mL（以親和層析法所得的AF部份），如上法注入管柱中，立刻開始進行膠體過濾，并收集各分劃。請依循上述所有管柱及分劃收集器的操作要點。
15）、收集所得，進行蛋白質定量分析，可定出數(shù)個蛋白質尖峰，以作為分子量依據(jù)；另以目測法，決定紅色高峰的管數(shù)，則可定出vitaminB12的溶離管數(shù)。利用以上數(shù)據(jù)，可畫出分子量與溶離管數(shù)間的直線關系，作為分子量判定的標準校正線。
16）、同樣的一批分劃，請進行酶活性分析（GUS），則可定出酶的溶離體積，對照上述標準校正線，則可求出酶的分子量。
四、 拆除管柱及保存膠體：
17）、若管柱長期不用，應當自管柱中取出膠體，以緩沖液清洗后，置冷藏室中保存，但絕對不要放在冷凍箱中。膠體若裝填太緊，有時可能不易取出，要有耐心地以緩沖液慢慢沖出來。
18）、膠體可以加0.01%NaN3防止霉菌生長，但使用前記得要洗去；再度使用時，請檢查膠體中有無灰黑色霉菌顆粒，若有結塊而不易打散者，也不要使用。