化工儀器網
技術文章
曲霉屬通用PCR試劑盒反應的五點要素
閱讀：1504 發布時間：2020-9-29曲霉屬通用PCR試劑盒注意事項：
1．基礎程序；
2．擴增溫度和延伸溫度；
3．反應時間；
4．循環次數；
5．PCR 反應液的配制；
6．PCR技術的基本原理；
7．PCR的反應動力學；
8．PCR擴增產物；
9．PCR反應體系與反應條件。
曲霉屬通用PCR試劑盒反應五要素：
參加曲霉屬通用PCR試劑盒反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物：引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論
上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模
板DNA在體外大量擴增。設計引物應遵循以下原則：
①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。
②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。
③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。
ATGC*隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，
產生非特異的擴增條帶。
⑤引物3'端的堿基，特別是末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導
致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列*有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克
隆很有好處。
⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。引物量：每條引物的濃度0.1～
1umol或10～100pmol，以*引物量產生所需要的結果為好，引物濃度
偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。