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同時分析301種藥物/毒物的實驗和譜庫檢索方法
閱讀：976 發布時間：2020-9-19目前，西方國家每年發生幾十萬例由于服用毒物和藥物而引起的中毒事件，因此，臨床學和法醫學需要發展一種快速篩選方法，來測定毒物和藥物及其代謝產物。傳統的檢測方法包括免疫法（只適合測定少數種類化合物）、LC-UV（DAD）、GC-MS等方法，配合使用Pfleger-Maurer-Weber GC-MS 譜庫和Pragst UV譜庫。1998年以后，由于LC-MS的源內裂解（In-source CID）及其產生的譜庫的發展，使之成為法醫學快速篩選檢測的主要方法之一。隨后，LC-MS/MS的子離子掃描和MS/MS譜庫檢索使得法醫學和臨床藥物代謝的快速檢測的準確性和速度大大提高。據統計，在芬蘭，2000—2003年中只有87種常見的毒物用其他方法（GC、GC-MS，TLC、HPLC）等檢測，采用LC-MS/MS的MRM掃描和子離子掃描譜庫檢索同時檢測和鑒定血液樣品中的238種常見毒物。但需要注射2次樣品：一次進行MRM掃描分快速篩選；另一次進行子離子掃描譜庫檢索[1，2] 。
新型串聯四極桿質譜——四極桿和線性離子阱質譜儀QTRAP®[3] ，利用其“信息關聯掃描informationdependent acquisition (IDA)”技術使得只注射一次樣品即可同時進行快速篩選和鑒定實驗。線性離子阱克服了3D離子阱的“低質量數截止效應”（1/3效應）；在一定循環時間（cycle time內）串聯四極桿MRM掃描模式可以容納更多的離子，掃描速度快，信噪比更高；而3D離子阱在SRM（選擇反應監測）模式下只能有少量離子穩定存在。因此，串聯四極桿的MRM的離子傳輸率比3D離子阱高10倍。在QTRAP® 中Q3既可以當做四極桿，也可當做線性離子阱使用。因此，第yi個好處是在進行多組分目標化合物快速定量分析時，可以充分利用MRM的高靈敏度和選擇性；第二個好處是可以利用線性離子阱全掃描的高靈敏度特性[3] 。在QTRAP® 的EPI掃描模式中，Q1用做母離子的選擇過濾器，Q2用做碰撞室產生碎片離子，Q3用做線性離子阱掃描所有的子離子。其結果是，仍然采用了串聯四極桿的碎片斷裂方式，但靈敏度更高。本工作研究了法醫學和臨床醫學中可能產生中毒事故的301種藥物、毒物的快速檢測方法，并運用新發展的EPI MS/MS譜庫檢索進行這些藥物和毒物的鑒定。
化學試劑所有試劑均為分析純或HPLC級：乙腈、丙酮、銨水溶液（25%）、二氯甲烷、甲酸（98%~100%）、去離子水、甲醇、K2HPO4、KOH、NaOH、2-丙醇、磷酸（85%）、丁酸乙酯（99%）(Merck, Darmstadt, Germany)、甲酸銨、乙酸銨、TRIZMA堿(Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)、NaCl、D3-doxepin凱蘇、D5- 安定、D3-THC-COOH) (Radian/Promochem Wesel, Germany)。
樣品制備基于Gergov et al [4] 的LLE方法：在1mL血清中加入300 µL 1mol/L的TRIS緩沖液（pH=11）和20 µL D3-doxepin凱蘇作為內標，加入 500µL丁酸乙酯進行堿性萃取。加入75µL乙酸銨（10mmol，Ph=3.2，0.1%甲酸銨）到有機相中。然后在氮氣流保護下于40℃蒸發至干，殘渣再溶解于75µL乙腈。渦旋振蕩和高速離心后，萃取液轉入自動進樣器樣品瓶中。在堿性萃取剩余的水相中加入120mg NaCl, D3-THC-COOH (200 ng/mL)作為內標，用500µL磷酸緩沖液（1mol/L，pH=3）和600µL磷酸（8.5%）進行酸性/中性萃取。用5mL二氯甲烷/2-丙醇（V/V=95 / 5，在 250 r/min振蕩30min）萃取后，在氮氣流保護下于40℃蒸發至干，殘渣再溶解于150µL流動相（A/B：V/ V=80/20），離心后，上清液與堿性萃取得到的上清液合并，待分析。
基于Chen et al. [5] 和Muller,et al. [6] 的SPE方法：各加入10 µL D3-doxepin凱蘇和D5-安定(10 µL/mL)內標、2 mL磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH=6）后，用自動SPE萃取裝置 (rapid trace, Zymark, Idstein/Germany)，萃取柱為硅基混合模式反相C8和陽離子 SPE交換柱“Chromabond drug 200 mg”(Macherey-Nagel,Duren, Germany), 用1.5 mL丙酮/二氯甲烷（V/V=1/1）進行酸性/中性萃取；用1.5 mL二氯甲烷/異丙醇/25%銨水(V/V/V=80/20/2)進行堿性萃取。二萃取液在氮氣流保護下于40 ℃蒸發至干，殘渣再溶解于100 µL流動相（A/B：V/V=80/20）中，待分析。
色譜分離條件 Agilent 1100 系統：二元泵系統、自動進樣器、柱溫箱。色譜柱：Phenomenex ，4µm，C18，150mm×2mm；預柱4mm×2mm。流動相：A相—0.1%甲酸+1mmol/L甲酸銨；B相—乙腈/0.1%甲酸銨(V/V=95/5)。
MS/MS檢測 QTRAP® LC-MS/MS系統，TurboIonSpray ® 離子源。采用正離子方式模式掃描298組MRM離子對進行 301種藥物和毒物以及3個氘代化合物的快速篩選。每組離子對駐留時間為5ms，停留時間為2ms，碰撞能（CE）為20、35、50 eV。每個化合物的MRM離子對和碰撞能根據增強子離子譜（EPI掃描模式）來選擇，EPI譜用于298組離子對設定譜庫檢索的時間是 2.1s。 IDA掃描強度的閾值500cps，關聯掃描是分別在 20、35、50 eV碰撞能下進行3個EPI掃描，然后自動切換至MRM掃描模式，大循環時間是3.8 s。動態排除（Dynamic exclusion）為一個離子對在采集一個EPI掃描后被排除所定義的時間是60 s，這樣允許檢測共洗脫物和同分異構體，靈敏度提高10~100倍，這對中毒案件特別重要。產生的EPI圖譜然后進行質譜庫檢索。
結論本方法的結果經過HPLC篩選方法確證，結果準確無誤。其優點是，與Gergov et al. [4] 的LC-MS/MS方法相比較，只需一次進樣，因此，分析時間大大縮短。