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產品簡介
| 供貨周期 | 現貨 | 貨號 | 64CRAFTPEH |
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產品介紹
產品參數
| 產品貨號 | 產品名稱 | 規格 |
| 64CRAFTPEH | HTRF CRAF TOTAL KIT | 10K PTS |
總 cRaf 細胞檢測試劑盒旨在使用簡化的混合后直接讀取、無需洗滌的方案，對總 cRaf 進行定量。cRaf 在細胞增殖和分化中起著關鍵作用。該試劑盒可用于從基礎研究到高通量藥物篩選。它的多功能性意味著它適用于許多應用，從基礎研究到細胞模型中的藥理學問題分析，并在腫瘤學和傳染病研究中有應用。
產品特點
工作原理：
總 cRaf 檢測原理：
總 cRaf 檢測用于量化細胞裂解物中 cRaf 的表達水平。與蛋白質印跡法不同，該檢測基于微孔板，不需要凝膠、電泳或轉膜。總 cRaf 檢測使用兩種標記抗體，一種與供體熒光團偶聯，另一種與受體偶聯。這兩種抗體對蛋白質上不同的表位具有高度特異性。在細胞提取物中存在 eNOS 的情況下，加入這些偶聯物會使供體熒光團與受體緊密接近，從而產生熒光共振能量轉移（FRET）信號。其強度與樣品中存在的蛋白質濃度直接成正比，并在無需洗滌的檢測形式下提供了一種評估蛋白質表達的方法。
總 cRaf 雙板檢測方案：
雙板方案涉及在 96 孔板中培養細胞，然后進行裂解。接著將裂解物轉移到 384 孔低體積檢測板中，之后加入 HTRF 總 cRaf 檢測試劑。該方案能夠監測細胞的活力和融合度。
總 cRaf 單板檢測方案：
使用 HTRF 試劑檢測總 eNOS 可以在一個用于培養、刺激和裂解的單板上進行。無需洗滌步驟。這個為高通量篩選設計的方案能夠實現微型化，同時保持強大的 HTRF 質量。
檢測驗證：
在 TPA 刺激的 HeLa 細胞中檢測總 c-RAF 和磷酸化 c-RAF（S43）：
HeLa 細胞以 100 微升的體積接種在 96 孔板中（每孔 100,000 個細胞），使用培養基并在 37°C、5% 二氧化碳的條件下孵育過夜。第二天，移除培養基，加入 50 微升無血清培養基，在 37°C、5% 二氧化碳的條件下使細胞饑餓 5 小時。然后用 50 微升不斷增加濃度的 TPA 在 37°C、5% 二氧化碳的條件下處理細胞 15 分鐘。
移除培養基后，用 50 微升補充裂解緩沖液 #2 在室溫下輕輕振蕩裂解細胞 30 分鐘，然后將 16 微升裂解物轉移到低體積白色微孔板中，再加入 4 微升預混的 HTRF 磷酸化 cRaf（Ser43）或總 cRaf 檢測試劑。孵育過夜后記錄 HTRF 信號。
在 TPA 刺激的 HEK293T 細胞中檢測總 c-RAF 和磷酸化 c-RAF（S43）：
HEK293T 細胞以 100 微升的體積接種在 96 孔板中（每孔 100,000 個細胞），使用培養基并在 37°C、5% 二氧化碳的條件下孵育過夜。第二天，移除培養基，加入 50 微升無血清培養基，在 37°C、5% 二氧化碳的條件下使細胞饑餓 5 小時。然后用 50 微升不斷增加濃度的 TPA 在 37°C、5% 二氧化碳的條件下處理細胞 15 分鐘。
移除培養基后，用 50 微升補充裂解緩沖液 #2 在室溫下輕輕振蕩裂解細胞 30 分鐘，然后將 16 微升裂解物轉移到低體積白色微孔板中，再加入 4 微升預混的 HTRF 磷酸化 cRaf（Ser43）或總 cRaf 檢測試劑。孵育過夜后記錄 HTRF 信號。
簡化的通路：
RSK1 的功能和調節：
RAF 原癌基因絲 / 蛋白激酶（c-RAF）是 MAP 激酶通路的一部分，它將上游效應物 Ras 與下游 MAPK/ERK 級聯連接起來。因此，它在包括增殖、分化、凋亡、存活和致癌轉化在內的細胞命運決定中發揮作用。
c-RAF 通過 PKC 的直接或間接作用在 Ser338 位點磷酸化而被激活，或者通過與 GTP 結合的 Ras 直接激活。通過 MAPK/ERK 依賴性反饋在 Ser43 位點磷酸化確保其失活。
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