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德國(guó)拜發(fā)甘油檢測(cè)試劑盒

甘油檢測(cè)試劑盒

（酶學(xué)試劑盒）

酶法分析試劑盒（紫外分光光度法）

RIDASCREEN（產(chǎn)品編號(hào)：0 414 433）      30次檢測(cè)

1. 簡(jiǎn)介

酶法分析試劑盒（紫外分光光度法）此法適用于檢測(cè)食品（啤酒、葡萄汁、醋、蜂蜜、酒精、果酒）、化妝品、藥品（溶液、栓劑）、紙板、煙草及生物制品中的甘油。

2.  原理

甘油在甘油激酶的催化下可被ATP磷酸化為3-磷酸甘油酯，ATP轉(zhuǎn)化為ADP； 反應(yīng)式為

                GK

Glycerol﹢ATP           L-glycerol-3-phosphate﹢ADP

上式中形成的ADP在丙酮酸激酶的催化下可與PEP作用下生成ATP及丙酮酸酯； 反應(yīng)式為

           PK

ADP﹢PEP          ATP﹢Pyruvate

丙酮酸酯在L-乳酸酯脫氫酶的作用下可被NADH還原為L(zhǎng)-乳酸酯，NADH被氧化為NAD； 反應(yīng)式為

                  L-LDH

Pyruvate﹢NADH﹢H﹢       L-lactate﹢NAD﹢

被氧化的NADH的量取決于甘油的量，NADH的吸光度值可在334，340及365nm下測(cè)量。

3.  試劑盒內(nèi)容物

----瓶1共有3瓶，每瓶約有2g輔酶及緩沖液的混和物，包括：甘氨酰甘氨酸緩沖液， PH約7.4； NADH約7mg；ATP約22mg；PEP-CHA約11mg；硫酸鎂

----瓶2約0.4ml懸浮物，包括：

丙酮酸激酶，約240U； L-乳酸酯脫氫酶，約220U

----瓶3約0.4ml甘油激酶懸浮物，約34U

----瓶4為甘油檢測(cè)對(duì)照溶液（甘油檢測(cè)對(duì)照溶液可不需要計(jì)算結(jié)果），此溶液使用時(shí)不需稀釋。（效期見(jiàn)標(biāo)簽）

4.  檢測(cè)溶液的制備 （10次）

----取出1瓶瓶1， 用11ml重蒸水溶解，使用時(shí)此溶液需在20-25℃持續(xù)回溫約10分鐘

----瓶 2不需稀釋

----瓶 3不需稀釋

5.  操作者應(yīng)該注意之事項(xiàng)

使用前請(qǐng)仔細(xì)閱讀，中文翻譯件僅供參考

----瓶1約含500mg碳酸鈉，應(yīng)避免接觸皮膚和呼吸器官，其他用于甘油檢測(cè)的試劑不具有危險(xiǎn)性

----實(shí)驗(yàn)之后，用過(guò)的試劑可作為實(shí)驗(yàn)室廢料處理，但必須在當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)允許的前提下

6.  儲(chǔ)存條件

----瓶 1在2-8℃下保存（見(jiàn)標(biāo)簽），溶液1在2-8℃下可保存4天，溶液1使用前需回溫至20-25℃

----瓶2及3在2-8℃下保存（見(jiàn)標(biāo)簽）

7.  樣品處理

----直接取用無(wú)色，透明，中性的溶液或按稀釋表格稀釋后進(jìn)行檢測(cè)，體積為2.000ml

----過(guò)濾混濁溶液

----除去樣品溶液中的二氧化碳?xì)怏w

----加入氫氧化鈉或氫氧化鉀來(lái)調(diào)節(jié)酸溶液的PH值約為8

----對(duì)于深顏色的樣品溶液可不需稀釋或者用PVPP或酰胺配成較高濃度的溶液如：1g/100ml

----粉碎或均質(zhì)固體和半固體樣品，用水抽提或溶解，而后過(guò)濾，通過(guò)Carrez澄清液可脫去其中的混濁物或色素

----用Carrez試劑可脫去樣品中的蛋白質(zhì)

----用熱水抽提樣品中的脂肪（抽提溫度需在脂肪的溶解度之上），冷卻后可分離出脂肪，將余下物質(zhì)轉(zhuǎn)移至容量瓶中并加水至刻度，冰浴15分鐘而后過(guò)濾，熱水抽提后用Carrez溶液澄清

8.  過(guò)程

1.  波長(zhǎng)：340nm，Hg365nm或Hg334nm

2.  比色杯：光徑1.0cm

3.  溫度：20-25℃

4.  zui終體積：3.020ml

5.  對(duì)照空氣（光路上無(wú)比色杯）或?qū)φ账x取讀數(shù)

6.  樣品溶液：1-40ug甘油/檢測(cè)（體積為0.100-2.000ml樣品體積）

7. 具體操作見(jiàn)如下表格

分別測(cè)樣品與空白的吸光度值差，而后用樣品吸光度值差減去空白吸光度值差可以得到如下公式

△A=（A1 ―A2）Sample―（A1 ―A2）blank

若想得到一個(gè)足夠精確的結(jié)果，則測(cè)得的吸光度的單位至少為0.100單位。

如果吸光度值差△A在334及340nm下測(cè)得的值高于1.000或在365nm下測(cè)得的值高于0.500，如此則表明樣品溶液中甘油的濃度較高。

需根據(jù)稀釋表格進(jìn)行樣品的稀釋

9.  計(jì)算

根據(jù)以下公式計(jì)算濃度

V×MW

C=-----------------------×△A（g/l）

ε×d×v×1000

V=zui終體積（ml）

V=樣品體積（ml）

MW=被檢測(cè)物質(zhì)的摩爾質(zhì)量

D=光徑（cm）

ε=NADH的消光系數(shù)

340nm=6.3（1×mmol-1×cm-1）

Hg365nm=3.4（1×mmol-1×cm-1）

Hg334nm=6.18（1×mmol-1×cm-1）

甘油含量計(jì)算遵循如下公式

3.020×92.1

C=----------------------------×△A

ε×1.00×0.100×1000

2.781

=----------------×△A（g甘油/l樣品溶液）

ε

如果樣品溶液是稀釋使用的，在計(jì)算結(jié)果時(shí)需乘以稀釋系數(shù)F。

當(dāng)分析固體或半固體時(shí)，測(cè)量前需稱一定重量配制樣品溶液，其結(jié)果需按下式計(jì)算

C 甘油（g/l樣品溶液）

C甘油 =--------------------------×100（g/100g）

W 甘油（在樣品溶液中）

10. 檢測(cè)操作說(shuō)明

被檢樣品中甘油含量在1ug至40ug之間。

為了得到一個(gè)足夠的吸光度值差，樣品溶液的濃度稀釋在0.04g/L至0.4g/L之間。

稀釋表格

如果測(cè)得的吸光度值△A較低，例如低于0.100，則樣品溶液需重新配制，可由下列幾種解決方法

1. 可多稱出些樣品或不要過(guò)分稀釋。

2. 加入到比色杯中的溶液體積可增加至2.000ml，當(dāng)然為了得到相同的zui終體積（樣品和空白），加入的水的體積就要相應(yīng)減少。所加入的新溶液的體積在計(jì)算時(shí)是要考慮進(jìn)去的。

11. 技術(shù)信息

加入懸浮物2（PK/L-LDH）后等待前反應(yīng)進(jìn)行*后是非常必要的。

12. 特性

此法特異性適于甘油的檢測(cè)。

13. 靈敏度和檢測(cè)限

1. zui小的吸光分辨率為0.005個(gè)吸光單位，相應(yīng)的zui大樣品體積為2.000ml，340nm下測(cè)量，則樣品的甘油濃度為0.1mg/L；若樣品體積為0.100ml，則樣品的甘油濃度為2mg/L。

2. 340nm下，吸光度值差為0.020可導(dǎo)出檢測(cè)限為0.4mg/L，相應(yīng)的zui大體積為2.000ml。

14. 線性

從1ug甘油/檢品（0.4mg甘油 /L樣品溶液，樣品溶液V=2.000ml）到40ug甘油/檢品（0.4g甘油/L樣品溶液，樣品V=0.100ml）

15. 精確性

用同一樣品溶液做平行測(cè)定時(shí)，其吸光度值差會(huì)有0.005至0.010的差異，樣品體積為0.100ml，340nm下測(cè)量，相應(yīng)的甘油濃度約為2-5mg/L；若樣品是經(jīng)過(guò)稀釋的，則在計(jì)算結(jié)果時(shí)需乘以稀釋倍數(shù)。

16. 干擾信息來(lái)源

ATP和PEP的緩慢水解同NADH的緩慢氧化均可導(dǎo)致緩慢的蠕變反應(yīng)；空白和樣品的吸光度值可不必逐一立即檢測(cè)。

17. 檢測(cè)過(guò)程中的干擾

1. 根據(jù)過(guò)程中所給定的時(shí)間甘油若能轉(zhuǎn)化*，則可斷定沒(méi)有干擾發(fā)生。

2. 反應(yīng)結(jié)束后，可加入一些甘油重新檢測(cè)（定性或定量）：如果加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)后，吸光度值會(huì)隨之改變，則可斷定沒(méi)有干擾發(fā)生。

3. 操作過(guò)程中的錯(cuò)誤和干擾可通過(guò)兩個(gè)樣品體積的平行實(shí)驗(yàn)測(cè)得（如0.100ml和0.200ml）：測(cè)得的吸光度值差應(yīng)與樣品體積成比例關(guān)系。

當(dāng)測(cè)定固體樣品時(shí)，可稱取不同質(zhì)量（如1g和2g）于同一100ml容量瓶中，測(cè)得的吸光度值差及樣品的質(zhì)量應(yīng)與樣品的體積成比例關(guān)系。

4. 樣品所含物質(zhì)帶來(lái)的可能干擾可通過(guò)加入內(nèi)標(biāo)來(lái)控制：除去樣品、空白及標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)外，樣品加檢測(cè)對(duì)照溶液也要檢測(cè)的，測(cè)得的吸光度值差可計(jì)算干擾。

5. 通過(guò)回收試驗(yàn)可測(cè)定可能的損失：分別測(cè)定加入標(biāo)準(zhǔn)與不加入標(biāo)準(zhǔn)的樣品，在誤差范圍之內(nèi)可定量測(cè)定附加物。

18.  Carrez試劑的澄清作用

----移取液體樣品于盛有60ml重蒸水的100ml容量瓶中或稱取足夠重量的樣品于100ml容量瓶中

----加入60ml重蒸水

----仔細(xì)加入5mlCarrez-Ⅰ-溶液（85mM，3.60gK4Fe（CN）6*3H2O/100ml）和5ml Carrez-Ⅱ-溶液（250mM，7.20gZNSO4*7H2O/100ml）

----用氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液PH于7.5-8.5，加入每一溶液后需充分混和，加水至容量瓶刻度，混和并過(guò)濾

19.  應(yīng)用舉例

1.果汁中甘油的檢測(cè)

----稀釋樣品其濃度約在0.4g/L以下（見(jiàn)稀釋表格）

----過(guò)濾混濁果汁，取用透明或淡色溶液用于檢測(cè)

當(dāng)分析深色果汁時(shí)（如：草莓汁和紅葡萄汁）需要先脫色

具體操作

----在10ml果汁中加入0.1g酰胺粉末或PVPP

----攪拌1分鐘后過(guò)濾

----取透明溶液用于檢測(cè)，該溶液可帶有輕微顏色

2.酒中甘油的檢測(cè)

----根據(jù)稀釋表格將樣品進(jìn)行稀釋

----實(shí)際上紅酒不需脫色也可進(jìn)行檢測(cè)

3.啤酒中甘油的檢測(cè)

----取5-10ml啤酒用玻璃棒攪拌約1分鐘，除去其中的二氧化碳?xì)怏w

----根據(jù)稀釋表格稀釋脫去二氧化碳?xì)怏w后的樣品

4.煙草制品中甘油的檢測(cè)

----充分混合并絞碎樣品

----精確稱取1g樣品于100ml容量瓶中

----加入約70mL水磁力攪拌約1小時(shí)20-25℃下，而后加水至刻度，混和并過(guò)濾

----移取25ml濾液于50ml容量瓶中

----加入5mlCarrez-Ⅰ-溶液，5ml Carrez-Ⅱ-溶液及10ml氫氧化鈉溶液，在加入每一溶液后均需充人混和

----加水至刻度混和并過(guò)濾，取濾液用于檢（0.100ml-0.500ml）

5.化妝品中甘油的檢測(cè)

6.發(fā)酵產(chǎn)品及生物培養(yǎng)基中甘油的檢測(cè)

----置樣品（可先經(jīng)過(guò)離心）于80℃水浴中15分鐘以停止酶的反應(yīng)

----離心并取上層溶液（可根據(jù)稀釋表格稀釋）用于檢測(cè)

----另外可用高氯酸或Carrez溶液脫除蛋白質(zhì)

瓊脂培養(yǎng)基需先均質(zhì)，而后按以上方法進(jìn)行操作。

德國(guó)拜發(fā)甘油檢測(cè)試劑盒