產(chǎn)品名稱：EZ®細(xì)胞及動(dòng)物組織DNA直擴(kuò)PCR試劑盒

英文名稱：EZ Cell and Tissue DNA Direct PCR Kit

產(chǎn)品規(guī)格：50T/200T

產(chǎn)品價(jià)格：420/1350元

試劑盒應(yīng)用：

動(dòng)物組織或細(xì)胞DNA的擴(kuò)增與克隆、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株篩選、DNA病毒基因擴(kuò)增、DNA病毒普通PCR診斷、DNA病毒Real-time PCR診斷（Taqman法）等。

試劑盒組成：

DNA-EZ-1、DNA-EZ-2、DNA-EZ-3、2×TaqMix、H2O

保存條件：

-20ºC保存。使用前將DNA-EZ-1、DNA-EZ-3在室溫或37ºC充分溶解。DNA-EZ-2和2×TaqMix需置于冰上。

EZ®細(xì)胞及動(dòng)物組織DNA直擴(kuò)PCR試劑盒使用方法：

1、細(xì)胞或組織樣品中DNA的擴(kuò)增

1 將DNA-EZ-1與DNA-EZ-2以5：1的比例充分混合。

2 取20 µL細(xì)胞樣品（105-106 cells/mL）或研磨的組織樣品，加入6 µL上述混合液，混勻。

3 置于50ºC靜置10分鐘后，再置于95ºC加熱10分鐘。

4 加入50 μL的DNA-EZ-3，混勻。

5 取2 μL上述處理液進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2、組織塊中DNA的擴(kuò)增

1 用H2O將DNA-EZ-1稀釋5倍，每25 μL的DNA-EZ-1稀釋液加入1 μL的DNA-EZ-2，混合均勻。

2 切取半顆米粒大小的組織塊（< 3 mm3），并*浸入上述混合液中。

3 50ºC加熱30分鐘，每隔10分鐘取出混勻一次。

4 95ºC加熱10分鐘。

5 加入50 μL的DNA-EZ-3，混勻。

6 取2 μL上述處理液進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

3、Real-time PCR

取上述細(xì)胞或組織處理液，加入特異性引物和Taqman探針，可進(jìn)行特異性靶標(biāo)DNA的定量檢測(cè)。

取上述細(xì)胞或組織處理液，加入SYBR Green PCR試劑（需自備），可進(jìn)行特異性靶標(biāo)DNA的相對(duì)定量檢測(cè)。

4、PCR加樣體系

5、PCR程序設(shè)定

注意事項(xiàng)

（1）取樣的細(xì)胞量應(yīng)當(dāng)適中，濃度不宜過高或過低，處理后溶液應(yīng)當(dāng)以透明為宜。

（2）樣品處理過程中應(yīng)當(dāng)防止交叉污染，推薦設(shè)置陰性對(duì)照參與處理過程，以檢測(cè)環(huán)境的污染。

（3）PCR的退火溫度可根據(jù)引物的預(yù)測(cè)Tm值減去5ºC，或者通過梯度PCR摸索較佳退火溫度。

（4）上述步驟同樣適用于相應(yīng)的細(xì)胞或組織中DNA病毒的PCR診斷。在進(jìn)行組織中DNA病毒的診斷時(shí)，為保證準(zhǔn)確度，推薦將病料組織研磨后再進(jìn)行上述處理和擴(kuò)增。

（5）TaqMix中加入了染料和相應(yīng)試劑，普通PCR后可直接進(jìn)行電泳，無需另加Loading buffer。

（6）處理96孔板中的細(xì)胞時(shí)，可如“組織塊DNA擴(kuò)增”第1步中的方法，配置裂解液后，使用排槍直接加入96孔板裂解細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)高通量操作。

（7）TaqMix中的染料不影響Taqman探針的效果。

 應(yīng)用案例：細(xì)胞及動(dòng)物組織DNA直擴(kuò)PCR試劑盒

 細(xì)胞中皰疹病毒基因的直接擴(kuò)增。取病毒細(xì)胞培養(yǎng)液40ul，用EZ010試劑盒進(jìn)行直接擴(kuò)增，其中1971bp的片段G+C含量大于75%，結(jié)果表明，用該方法可直接擴(kuò)增細(xì)胞中近2000bp的DNA片段。

 某皰疹病毒的Taqman探針法定量檢測(cè)。將病毒進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋，用EZ010試劑盒處理后，加入特異性Taqman探針，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，檢測(cè)曲線呈現(xiàn)明顯的梯度關(guān)系，樣品間重復(fù)性良好，Ct值線性模擬R2=0.9978