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微生物菌種的研究進展
閱讀：526 發(fā)布時間：2017-7-24一，微生物菌種發(fā)酵工藝研究進展
在丁酸梭菌的液態(tài)培養(yǎng)方面，戚薇等采用單因素和正交試驗優(yōu)化得到*培養(yǎng)基組成為（g/L）：胰蛋白胨10，葡萄糖8，酵母膏4。于37℃培養(yǎng)24 h，活菌數(shù)可達4.1×108 CFU/mL，培養(yǎng)基中添加K2HPO4 5 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、MnSO4·H2O 0.2 g/L、CaCO3 1 g/L，培養(yǎng)32 h，活菌數(shù)芽孢轉化率可達95%，也簡化了培養(yǎng)基成分。其中，的工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基被確定為每升培養(yǎng)液中含有8 g 葡萄糖、20 g 豆粕（中性蛋白酶水解3 h）和5 g 啤酒酵母粉，zui適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)48h，丁酸梭菌活菌數(shù)可達8×108 CFU/mL，使成本降低了90%。至于固態(tài)發(fā)酵技術的應用，王海寬等在丁酸梭菌固態(tài)發(fā)酵方面已經(jīng)獲得了授權，丁酸梭菌活菌數(shù)大于1.0×109 CFU/g。
此外，Hakalehto 等發(fā)現(xiàn)CO2 是梭狀芽孢桿菌生長的一個必要的信號，在丁酸梭菌的純培養(yǎng)過程中，外部環(huán)境中沒有CO2 將導致其生長的大量延遲或難以啟動；丁酸梭菌與短乳桿菌存在著共生關系，同時短乳桿菌產(chǎn)生的CO2 能夠更好地啟動丁酸梭菌的生長。亦有學者利用丁酸梭菌跟鼠李糖乳桿菌、雙歧桿菌、酵母菌混合培養(yǎng)來制備丁酸梭菌復合制劑，并將其作為醫(yī)藥和飼料添加劑應用于人類和養(yǎng)殖動物。
二，丁酸梭菌在臨床上的應用
60 多年前，日本就已經(jīng)實現(xiàn)了丁酸梭菌的商業(yè)化，自此，丁酸梭菌先后被用作人用處方藥、非處方藥、獸藥、飼料添加劑及保健食品等，且丁酸梭菌制劑在國內(nèi)外臨床應用已有幾十年的歷史。
我國對丁酸梭菌作為益生菌劑的研究起步于20 世紀90 年代，經(jīng)過20 余年的動物試驗以及臨床上的應用，證實丁酸梭菌的急性毒素實驗和艾姆斯試驗均呈安全性，丁酸梭菌制劑能有效治療嬰幼兒功能不健全、正常菌群失調(diào)、腸易激綜合癥和輔助治療鵝口瘡、反復呼吸道感染、手足口病等相關疾病，以及放療和化療造成的免疫功能下降。
2004 年，青島東海藥業(yè)有限公司的丁酸梭菌制劑被國家食品藥品監(jiān)督管理局批準為新藥，2005 年3 月，口服丁酸梭菌膠囊、片劑和散劑的通過了國家食品和藥品監(jiān)督管理局的GMP 認證，隨后作為非處方藥全面上市，使中國成為第二個實現(xiàn)丁酸梭菌制劑產(chǎn)業(yè)化的國家。
1. 嬰幼兒功能不健全相關疾病
人腸道菌群的建立始于新生兒被分娩的過程，出生后的嬰兒則從母親的皮膚及乳汁、身邊的物體、周圍的空氣等環(huán)境中得到細菌“種子”，而某些“種子”的缺乏將導致微生態(tài)調(diào)節(jié)機制不健全，同時由于新生兒機體功能不健全，諸如兒童營養(yǎng)不良、早產(chǎn)兒喂養(yǎng)不耐受、新生兒高膽紅素血癥等相關疾病具有較高的發(fā)病率。
丁酸梭菌在防治早產(chǎn)兒喂養(yǎng)不耐受和治療兒童營養(yǎng)不良的臨床應用，證實了丁酸梭菌活菌散能加速腸黏膜上皮細胞的生長和早產(chǎn)兒腸道發(fā)育成熟，促進腸蠕動，恢復腸動力；產(chǎn)生多種消化酶和葉酸、B 族維生素等，促進食物的消化、吸收和補充營養(yǎng)物質(zhì)從而有效的治療兒童營養(yǎng)不良和早產(chǎn)兒喂養(yǎng)不耐受。在預防治療新生兒黃疸中，丁酸梭菌產(chǎn)生的丁酸，降低了β-葡萄糖醛酸苷酶的活性，競爭性地阻止結合膽紅素分解為非結合膽紅素，減少肝腸循環(huán)，同時促進腸蠕動加快，促進排便，增加膽紅素的排泄，從而有效的（P<0.05）減輕新生兒黃疸的程度、降低高膽紅素血癥的發(fā)生率。
2. 正常菌群失調(diào)的相關疾病
由于宿主的神經(jīng)性、功能性或器質(zhì)性的改變，或致病性細菌、病毒乃至霉菌的入侵，或服用抗菌藥物等都會導致正常菌群失調(diào)而引起小兒急性腹瀉、小兒秋冬季腹瀉、繼發(fā)性腹瀉、病毒性腹瀉、抗生素相關性腹瀉、腸易激綜合癥等相關疾病；腸道有害菌移位產(chǎn)生的內(nèi)源性感染，先天性免疫失調(diào)引發(fā)的免疫紊亂等，都將導致腸道局部黏膜受損，進而引發(fā)相關的腸道炎癥（慢性末端回腸炎、潰爛性結腸炎和壞死性小腸結腸炎等），而丁酸梭菌產(chǎn)生的丁酸能抑制去乙酰化酶活性、產(chǎn)生的葉酸參與基因的甲基化和去甲基化，調(diào)節(jié)宿主的基因表達，從而預防和治療腸炎、腸癌。
目前，丁酸梭菌制劑的臨床應用于治療正常菌群失調(diào)引起的相關疾病的療效顯著，具有統(tǒng)計學意義，且無不良反應。抗生素相關性腹瀉是幽門螺桿菌*治療過程中導致腸道微生態(tài)功能失調(diào)的副作用，而在微生物菌種*治療過程的同時，服用一定劑量的丁酸梭菌制劑，結果在治療組未發(fā)現(xiàn)腹瀉的情況，亦沒有檢測到艱難梭菌毒素A。丁酸梭菌制劑治療慢性末端回腸炎療效顯著（有效率97.5%），大便性狀、腹部疼痛、腸鳴音得到明顯改善，其機理是TOLL-樣受體4 能夠識別丁酸梭菌導致IL-10 的分泌，而IL-10 在抵消機體過度免疫應答方面起重要作用，丁酸梭菌產(chǎn)生的丁酸能加強腸黏膜的能量、營養(yǎng)代謝，抑制炎癥因子的過度表達，修復胃黏膜，提高機體免疫。
3. 輔助治療
鵝口瘡、反復呼吸道感染、手足口病等疾病是由致病性微生物等直接引起的疾病，在常規(guī)臨床治療的同時利用丁酸梭菌制劑進行輔助治療，頗具成效，形成了新的治療理念。
鵝口瘡是兒科常見多發(fā)病癥，是由念珠菌感染引起的口腔黏膜急性假膜性損害，甚至引起念珠菌性食道炎或肺念珠菌病，出現(xiàn)呼吸困難而危機生命，但常規(guī)治療后短期易復發(fā)。鄒積茹等現(xiàn)丁酸梭菌制劑能夠促進腸黏膜大量分泌免疫球蛋白sIgA，sIgA 是黏膜免疫的主要抗體并血液循環(huán)到達口腔黏膜，丁酸梭菌還能促進巨噬細胞的功能以增強細胞免疫，聯(lián)合制霉菌素對鵝口瘡進行治療，治療結果顯著，且復發(fā)率大大降低（P<0.05），丁酸梭菌活菌散與制霉菌素片聯(lián)用治療嬰幼兒鵝口瘡是一種理想的選擇，值得臨床推廣應用。
反復呼吸道感染是小兒常見病，發(fā)病率達20%左右。張永紅等證實丁酸梭菌、雙歧桿菌二聯(lián)活菌散對反復呼吸道感染尤其是反復上呼吸道感染具有預防和治療作用，發(fā)熱時間、咳嗽緩解時間、咽和扁桃體紅腫消退時間以及肺部濕啰音消失時間都顯著短于對照組（P<0.05），可作為兒科臨床上反復呼吸道感染患兒的一種治療選擇。手足口病是由腸道病毒引發(fā)，病毒在腸黏膜內(nèi)繁殖并持續(xù)釋放到血液，當利用丁酸梭菌制劑輔助治療手足口病時，患兒的皰疹消失時間、體溫恢復正常時間均明顯短于對照組。丁酸梭菌制劑具有抑制病毒代謝、繁殖和促進機體細胞免疫、體液免疫等功效，為手足口病提供了一種新的治療方法。
三，動物飼料中應用
食物傳染疾病的爆發(fā)強調(diào)了減少動物器官食物中病原菌的必要性，動物腸內(nèi)病原菌是食物污染的直接來源，世界對抗生素抗性基因能夠從動物轉移到人類的廣泛關注，導致歐盟決定自2006 年1 月1日禁止使用抗生素作為生長促進劑。丁酸梭菌制劑成為替代抗生素的一種理想選擇，既能減少抗生素的使用所引起的抗藥性、二重感染等，又能提高動物的自然防御機制和經(jīng)濟效益。我國農(nóng)業(yè)部已于2009 年7 月批注了丁酸梭菌制劑作為微生物飼料添加劑的使用。
1. 作為動物益生菌制劑
在韓國，丁酸梭菌制劑已經(jīng)被用于牛、豬和家禽的飼料添加劑。國內(nèi)諸多研究證實丁酸梭菌發(fā)酵能夠使飼料酸化軟化，提高營養(yǎng)物質(zhì)和適口性；在動物體內(nèi)以優(yōu)勢搶占空間生態(tài)位和營養(yǎng)生態(tài)位，產(chǎn)生多種益生物質(zhì)，提高飼料利用率；保持動物腸道內(nèi)微生物菌群正常化，產(chǎn)生丁酸梭菌素，抑制腸道有害菌，提高動物抗病力、免疫力，減少死淘率以及降低糞便中NH3、H2S 的含量，但目前丁酸梭菌制劑還未被普遍的作為益生菌劑添加于動物飼料。孫梅等研究成果是采用微膠囊化包埋丁酸梭菌，以提高丁酸梭菌作為飼料添加劑的使用效果。經(jīng)研究確定丁酸梭菌在采用4% 的海藻酸鈉和2% 的明膠混合物作為壁材的包埋劑中活菌數(shù)能增殖至4.9×109 CFU/mL， 包埋率達99.5%。微膠囊顆粒具備良好的穩(wěn)定性、耐熱性、腸溶性，耐酸性及耐膽鹽性試驗前后活菌數(shù)量差異不顯著（P>0.05），但耐胃酸及耐膽鹽較未包埋的對照組有顯著提高。zui終為微膠囊化丁酸梭菌作為飼料添加劑的實際應用奠定一定的理論基礎。
2. 改善動物的性能
丁酸梭菌制劑能減少動物飼料中抗生素、類激素類物質(zhì)的使用，改善動物的性能，提高禽畜肉蛋奶制品產(chǎn)量和魚類的受精率、產(chǎn)卵量、孵化率及魚苗成活率。家禽腸道絨毛的長度與其腸上皮細胞數(shù)量呈顯著正相關。當絨毛變長時，腸上皮細胞數(shù)增多，對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力增高。在1 日齡AA 肉雞中添加0.9% 丁酸梭菌能顯著提高腸道絨毛長度，從而也能顯著提高肉雞平均日增重量，且試驗組的發(fā)病率和死淘率均顯著低于對照組。在肉雞的飼料中添加適量的丁酸梭菌，盲腸消化物的pH 和盲腸的相對長度降低顯著，空腸黏膜上的堿性磷酸酶活性以及盲腸中的短鏈脂肪酸相對增加，暗示食用油和丁酸梭菌相互作用對肉雞腸道產(chǎn)生了健康的影響。
丁酸梭菌制劑可以顯著提高種鴨蛋的受精率。機理是丁酸梭菌在腸道內(nèi)可產(chǎn)生多種維生素和酶等物質(zhì)，有助于促使種番鴨對鈣、磷、錳、鋅、銅和鐵等的吸收，滿足種番鴨繁殖性能的需要，提高種公鴨的精液品質(zhì)及種蛋的受精率，又避免了使用抗生素而產(chǎn)生的種種弊端。
3. 改善動物產(chǎn)品質(zhì)量
丁酸梭菌制劑能調(diào)節(jié)動物腸道微生態(tài)平衡以及治療相關動物疾病，有效地減少二重感染和動物體內(nèi)的藥物殘留；增加血中蛋白氮的含量，改善蛋白質(zhì)的代謝，能降低血清中的膽固醇水平；產(chǎn)生各種益生物質(zhì)，利于補充必需的營養(yǎng)，維持機體正常生理功能，促進代謝，改善畜禽漁產(chǎn)品質(zhì)量，進而保證畜禽漁產(chǎn)品的質(zhì)量符合、加工、銷售及出口的標準，以沖破貿(mào)易上的“綠色壁壘”。
當肉雞的飼料中添加一定劑量的丁酸梭菌時，肉雞腹部脂肪中的脂蛋白脂肪酶活力、空腸黏膜中肝型脂肪酸結合蛋白基因的表達、胸肌中的十二碳五烯酸和n-3 不飽和脂肪酸的含量均增加顯著（P<0.05），同時肌肉的剪切力明顯降低，而對于胸肌中的滴水損失，飲食中的油脂（魚油）和丁酸梭菌存在著極顯著（P<0.01）的交互作用，有力地證明微生物菌種能夠改善肉制品的質(zhì)量和提高肌肉中必要的不飽和脂肪酸含量。