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①微生物菌種要選擇適于冷凍干燥的菌齡細胞；
②要選擇適宜的培養基，因為某些微生物對冷凍的抵抗力，常隨培養基成分的變化而顯示出巨大差異；
③要選擇合適的菌液濃度，通常菌液濃度越高，生存率越高，保存期也越長；
④在菌液內不添加電解質(如食鹽等)；
⑤可在菌液內添加甘油等保護劑，以防止在冷凍過程中出現菌體大量死亡的現象。同樣，也可添加各種糖類、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好保護效果的溶劑，但對有些微生物而言，不加保護劑時更有效。
⑥原則上應盡快進行冷凍處理，但當加入保護劑時，可靜置一段時間后再進行處理。
⑦就動物細胞而言，應在-20℃范圍內以1℃/min左右的速度緩慢降溫，此后必須盡快降到貯藏溫度；而對絕大多數微生物而言，則不必如此，如結構較為復雜的原蟲則可在-35℃范圍內進行緩慢降溫，而噬菌體則必需采用上述的二階段法進行冷凍；
⑧若進行長期保存，則貯藏溫度越低越好；
⑨取用冷凍保存的菌種時，應采取速融措施，即在35～40℃溫水中輕輕振蕩使之迅速融解。而就厭氧菌來說，則應選擇靜置融化的措施。當冷凍菌融化后，應盡量避免再次冷凍，否則菌體的存活率將顯著下降。
微生物菌種常用的冷凍保存法包括：
①低溫冰箱保存法(-20℃、-50℃或-85℃)：
低溫冷凍保存時使用螺旋口試管較為方便，也可在棉塞試管外包裹塑料薄膜。保存時菌液加量不宜過多，有些可添加保護劑。此外，也可用φ5mm的玻璃珠來吸附菌液，然后把玻璃珠置于塑料容器內，再放入低溫冰箱內進行保存的。
②干冰保存法(-70℃左右)：即將菌種管插入干冰內，再置于冰箱內進行冷凍保存；
③液氮保存法(-196℃)：是適用范圍zui廣的微生物保存法。
其操作步驟如下：
a、裝安瓶管：使用盡量濃厚的菌體懸浮于含有適當防凍劑(保存霉菌不用防凍劑)的滅菌溶液中，將0.2～1mL的這種溶液分裝于安瓶中，或在裝有分散劑的安瓶中直接接種，或將菌絲體瓊脂塊直接懸浮于分散劑中。
b、熔封安瓶管：若直接貯存于氣相液氮中(-150℃～-170℃)時，則不需熔封。
c、檢查安瓶管是否熔封良好：即在4℃下，將熔封安瓶管在適當的色素溶液中浸泡2～30分鐘后，觀察有無色素進入安瓶。
d、緩慢冷卻：微生物菌種將熔封安瓶管置于小罐中，然后用液氮氣以約1℃/min的速度冷卻至-25℃左右，也可在-20℃～-25℃的冰箱內緩慢冷卻30～60min。