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植原體菌種保藏方法說明
閱讀：609 發布時間：2017-6-20| 提 供 商 | 上海一研生物科技有限公司 | 資料大小 | 5.7KB |
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植原體是一類無細胞壁的原核微生物，能侵染包括農作物、林木、花卉、雜草等植物，給農、林業帶來巨大損失，近年來，此類病害在某些重要植物處于蔓延和加重的趨勢。這類微生物尚不能在人工培養基上離體培養，其細胞結構、與寄主植物的互作等方面也有其明顯不同特點，研究制定此類微生物的保藏技術規程，對于植原體菌種資源的規范和安全保藏、科學研究及合理利用具有重要意義
1、本規程適用于各類植原體菌種的保藏。
2、術語與定義
2.1植原體phytoplasma
指寄生于植物韌皮部和介體昆蟲體內的、具有三層單位膜結構的無細胞壁的原核生物。一般引起植物葉片黃化和發育畸形等癥狀。
2.2植物組織培養planttissueculture
在無菌的條件下，將離體的植物器官和組織在人工控制的環境下培養，使其再生形成完整植株的過程。培養植原體—植物共生體即是培養已感染植原體病菌的植物外植體。
3、原理
植原體菌種尚不能在離體人工培養基上培養。被感染的寄主植物攜帶植原體，因而通過對植物莖段的繁殖，即可達到對所攜帶植原體的繁殖和培養。植物組織培養和營養繁殖，使植原體所受的選擇壓力較低，較低的溫度條件可大大減緩植物和所感染植原體的代謝活動，從而減少菌株突變，降低繁殖速度，有效保持菌種原有性狀。
4技術要求
4.1保藏方法
用組織培養法保藏感染植原體的植物組織，于5-25C溫度范圍內保藏。
4.2植物組織培養基
選用適于植物組織正常生長的培養基，不含四環素簇抗生素或其它對植原體生長和繁殖有抑制作用的成分。
4.3培養溫度和光照
培養溫度20-28℃為宜
光照強度在1000-3000lx，光期為10-14h/d
4.4保藏溫度和時間
常溫保藏（20-28℃），保藏時間1-3個月
低溫保藏（6-10℃），保藏時間6個月至1年。
注：保藏溫度低于4℃會凍傷植物組織材料而導致植原體死亡。
4.5保藏期檢測
定期檢查保藏菌種的房間、冷庫、冰箱的溫度、濕度。
檢查各保藏試管有無雜菌污染現象，如發現雜菌污染，則取出該管重新移植，培養后補缺。
4.6移植復核
大量植原體-植物共生體進行移植時，各菌株的編號、所用培養基需仔細核對無誤。每次移植培養后，對照原保藏的菌株和菌種順序號卡片名錄，核實無誤再行存放。
4.7保藏指標
當獲得的組培苗表現典型癥狀或在熒光顯微鏡下觀察到特異植原體DNA熒光后即可進行菌株的保藏。
5操作方法與步驟
5.1帶菌外植體采集
在田間采集表現典型癥狀的新鮮枝條，剪去葉和嫩稍，經酒精消毒劑表面消毒后，截成具節莖段，移入培養基上培養。
5.2無雜菌組培苗的獲得
外植體長出新枝后，選無雜菌感染的外植體，截取新枝，移入新配制的培養基上培養和繁殖。如培養基被雜菌污染，將組培苗再進行表面消毒處理，移入新的培養基上培養，重復操作2-3次，直至獲得無雜菌組培苗為止。
5.3組織帶菌鑒定
用DAPI熒光顯微鏡技術和PCR技術鑒定組織帶菌狀況和濃度。
DAPI熒光顯微鏡技術步驟：取植物幼莖、葉柄或根等，進行組織切片，厚度在100mm左右，用5％戊二醛固定2小時左右，用0.1M磷酸緩沖液（pH7.0）洗滌后，用1mg/ml4'6－二瞇基－2－苯基吲哚（DAPI）染色，zui后置于落射熒光顯微鏡下檢查韌皮部特異性植原體DNA熒光，激發濾光片波長為365nm,阻斷濾光片波長為420nm。
PCR技術步驟：從組織中提取植物和植原體總DNA，用植原體16SrRNA等基因序列的引物進行PCR基因擴增，然后進行瓊脂糖電泳，檢測特異性擴增產物譜帶。
5.4常溫保藏
植原體-植物共生體在適宜的組織培養基上培養，并正常溫度和光照下（20-28C，光照強度在1000-3000lx）進行保藏，保藏周期為1-3個月。
5.5低溫保藏
將正常溫度和光照下（20-28C，光照強度在1000-3000lx）培養的植原體-植物共生體移入含組織培養基的試管內，移入6-10C低溫冷藏柜內保藏，1-2個月將試管暴露于正常培養溫度和光照條件下補光2-3天，然后存放于低溫冷藏柜繼續保藏，保藏周期為6個月至1年以上。