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大腸桿菌的檢測方法分析
閱讀：2203 發布時間：2017-3-14| 提 供 商 | 上海一研生物科技有限公司 | 資料大小 | 3.7KB |
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1.傳統檢測法
1.1 多管發酵法(MTF，Multiple－tube fermentation)
多管發酵法是根據大腸菌群能發酵乳糖產酸產氣的特征，檢測水樣中大腸菌群的方法。多管發酵的大腸菌群陽性，如果在 44.5℃的培養基上進行 24h的培養，能釋放出熒光產物而使培養基在紫外光源的照射下呈現熒光反應，此種方法即可檢測出樣本中是否含有大腸桿菌，具體步驟:取一定量水樣于乳糖蛋白胨培養液中進行初發酵實驗(推測實驗)，再進行平板分離(證實實驗)復發酵實驗鑒定(完成實驗)。根據各稀釋度發酵的管數查zui可能數(mostprobable number，MPN)表，求得每 10mL 或每升水樣中的大腸菌群數 該法方法簡單，實驗的要求和成本低，但是該方法易受其他因素的干擾而影響結果的準確性。
1.2 濾膜法(MF，membrane filter)
濾膜法是目前zui為流行的檢測水中大腸桿菌群的方法。濾膜法的具體步驟是首先將一定量的水體樣本注入 0.45μm的濾膜過濾，經過抽濾，水中的細菌則被留在濾膜上，將濾膜貼于品紅亞硫酸鈉培養基上培養 24h，溫度為恒溫 37℃，這使得菌群因發酵乳糖而使得濾膜，出現紫紅色，通過計算濾膜上的菌落進而計算出單位樣 本 中 的 大 腸 桿 菌 的 數 量。張 淑 蘭 等[1]用ISO9308－1 規定的濾膜法測定水中大腸桿菌回收率均值為 94.7% ，批內變異系數小于 0% ，檢出限為500mL 水樣可檢出 1 個 CFU。該方法費用較低、原理簡單、利于推廣，但檢測時間相對較長、步驟繁瑣、干擾因素多，不適于大量樣品的分析，無法滿足污染物品快速檢測需求。
1.3平板計數法(plate count)
該方法是統計物品含菌數的有效方法，操作的順序是首先將樣本進行適當稀釋，使其中的微生物充分分散成單個細胞，取定量的稀釋液進行培養使其逐漸生長成肉眼可觀察的菌落，然后通過稀釋度和樣本數量來計算菌數。但是，由于待測樣品往往不宜*分散成單個細胞，所以，長成的一個單菌落也可能來自樣品中的 2～3或更多 個 細 胞，因 此 平 板 菌 落 計 數 的 結 果 往 往偏低。
2.檢測新技術
2.1 ATP 生物發光技術
ATP 生物發光技術是近年來發展較快的微生物快速檢測方法。細胞內源性的ATP含量可以反應活細胞的數量和活性。其化學反應如下：ATP+D-Luciferin+O2→Oxyluciferin+AMP+PPi+O2+Light
當細胞受損或死亡時，其ATP值迅速下降或消失，基于這一原理，檢測細胞內的ATP含量，即可反應其細胞的存活狀況。
目前生物熒光反應法被廣泛用于食品加工條件的快速評價和食品微生物的快速檢測, 同時在HACCP 管理中也被廣泛用于關鍵控制點檢測, 與傳統檢測方法不同之處在于幾分鐘內可獲得結果, 靈敏、快速、簡便、穩定是ATP生物發光的主要優勢，其不足之處是熒光強度（RLU）和菌落形成單位（CFU）之間沒有直接關系，也無法對細菌的種屬進行鑒定[3]。
2.2 PCR檢測技術
PCR(polymerase chain reaction) 即聚合酶鏈反應技術，PCR 是指利用耐熱 DNA 聚合酶的作用,通過變性 - 延伸 - 復性的循環操作, 在體外迅速將DNA 模板擴增數百萬倍的一種克隆技術。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 擴增產物的熒光條帶。
在食品微生物領域中, PCR 用于快速檢測或鑒定食品中的微生物。已經有商業化的試劑盒。這些實驗在普通的實驗室也可以做, 當然, 實驗中存在假陽性 ( 即死細胞) 和假陰性 ( 聚合酶抑制劑或與目標微生物的遺傳接近性) 。
2.3 酶底物法
酶底物法已被列為(GB/T4789.32－2002)，用酶底物法來檢測大腸桿菌的主要原理是:大腸桿菌細菌能夠產生 β－半乳糖苷酶(β－D－galactosidase)，它能夠分解 ONPG(Ortho－nitro phenyl－β－D－galactopyr－anoside)，從而使得培養基呈現黃色，來檢測水樣中是否含有大腸桿菌 。利用大腸桿菌內源性 β－D－葡糖醛酸糖苷酶(β－D－glucuronidase，GUS)可以將 4－甲基傘形－β－D－葡糖醛 酸 糖 苷 ( 4 － Methylumbelliferyl － － β － D －glucuronidase，MUG)分解為葡萄糖苷、甲基傘形酮，從而形成熒光特異性的產物，在長波 UV 光為 366nm下可見，并且產物的熒光強度與大腸桿菌的數量呈現正比的關系，利用所得的線性關系可定量檢測食品中的大腸桿菌，但此方法與其他快速檢測方法相比較而言，耗時較長。