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大型真菌菌種保藏的基本原則、方法及技術(shù)要求
閱讀：3343 發(fā)布時(shí)間：2017-3-7ATCC菌種菌種保藏的原理是通過低溫、干燥、隔絕空氣和斷絕營養(yǎng)等手段，以達(dá)到zui大限度地降低菌種的代謝強(qiáng)度，抑制菌絲的生長和繁殖，使其生命活動降低到極低的程度或處于休眠狀態(tài)，從而延長菌種的保藏時(shí)間。
技術(shù)要求
1不同菌種應(yīng)根據(jù)要求選擇適合的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
2接種須無菌操作，避免雜菌污染。
3定期檢查
保藏期間要定期檢查保藏菌種的冰箱溫度和濕度；檢查保藏器皿的棉塞有無生霉現(xiàn)象，如發(fā)現(xiàn)異常則立即取出該管重新純化，經(jīng)培養(yǎng)后補(bǔ)上空缺；在低倍解剖鏡下抽樣檢查有無螨蟲等害蟲，發(fā)現(xiàn)時(shí)須及時(shí)消除。
方法與步驟
1斜面低溫保藏法
將要保藏的菌種接種在斜面培養(yǎng)基上，20℃－30℃培養(yǎng)，當(dāng)菌絲長滿斜面時(shí)取出，置于4℃冰箱或冰柜中保藏，每隔3-6個(gè)月轉(zhuǎn)接1次，具體間隔時(shí)間應(yīng)根據(jù)菌種特性確定。
1.1保藏設(shè)備和材料
4℃冰箱、超凈工作臺、高壓消毒器、菌種培養(yǎng)箱、酒精燈、三角瓶、接種針、試管、培養(yǎng)皿、漏斗、燒杯、吸管、瓊脂粉等等。
1.2斜面的制備
1.2.1器皿的準(zhǔn)備
在斜面制備的過程中要用到的一些玻璃器皿，如試管、培養(yǎng)皿、三角瓶、漏斗等，使用前洗凈，并于80℃烘干備用。
1.2.2培養(yǎng)基的制備
在燒杯中倒入500ml水，按配方稱取材料，依次加入水中，逐個(gè)溶解，zui后定容至1L(在加料過程中，先加緩沖化合物，然后是主要元素、微量元素，zui后加維生素等)。冷卻至室溫，調(diào)pH值。然后將瓊脂粉加入煮沸的液體培養(yǎng)基中，不斷攪拌至融化為止，zui后補(bǔ)足蒸發(fā)的水分。
1.2.3分裝
將配好的固體培養(yǎng)基趁熱進(jìn)行分裝，裝入試管中的培養(yǎng)基不宜超過試管高度的四分之一。在分裝過程中，應(yīng)注意勿使培養(yǎng)基沾污管口，以免弄濕棉塞造成污染。
1.2.4滅菌與擺放斜面
將包扎好的培養(yǎng)基滅菌（0.1MPa,30min）。滅菌完畢后擺放斜面時(shí)，斜面長度不得超過試管管長的一半。
1.2.5無菌檢查
將制備好的斜面放入30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天做無菌檢查。
1.3接種
在超凈工作臺上，用無菌接種針挑取菌絲體連同少量培養(yǎng)基，接種于適宜的無菌新鮮培養(yǎng)基斜面上，在管壁或小瓶外壁上分別貼好標(biāo)簽標(biāo)明菌株編號（或名稱），然后置于適宜溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.4ATCC菌種培養(yǎng)
培養(yǎng)4-30天后，根據(jù)菌落的形態(tài)和其它培養(yǎng)特征，判斷新培養(yǎng)物是否為原菌種，并注意有無雜菌污染現(xiàn)象。檢查無誤后，進(jìn)行保藏。
1.5低溫保藏
培養(yǎng)好的斜面于4℃－6℃保藏，相對濕度，通常在50%－70%以下。
1.6保藏時(shí)間
一般3－6個(gè)月。
1.7菌種的轉(zhuǎn)接
將斜面培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到適宜的新鮮斜面上，在適宜的培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
1.8菌種的復(fù)壯
如果發(fā)現(xiàn)菌種有退化現(xiàn)象，應(yīng)將退化的菌種引入原來的生活環(huán)境中使其生長和繁殖，然后再進(jìn)行純種分離，例如在宿主體內(nèi)生長等方法進(jìn)行復(fù)壯。
1.9斜面低溫保藏法應(yīng)注意事項(xiàng)
——每次轉(zhuǎn)接時(shí)，應(yīng)仔細(xì)核對各菌株的編號、所用培養(yǎng)基等，發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤立即糾正。
——每次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后，應(yīng)對照原保藏的菌株和菌種順序號卡片名錄，檢查其培養(yǎng)特征，核實(shí)無誤后，再行存放。
——斜面低溫保藏的菌種，一般每個(gè)菌株應(yīng)保藏相繼的三代培養(yǎng)物，以便對照。
2液氮超低溫保藏法
2.1保藏設(shè)備和材料
液氮罐、程控降溫儀、超凈工作臺、高壓消毒器、菌種培養(yǎng)箱、酒精燈、培養(yǎng)皿、打孔器、安瓿管（圓底硼硅玻璃制品或螺旋口的塑料管），10%甘油或5%或10%的二甲基亞砜、馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂粉等。
2.2安瓿管的清洗和消毒
安瓿管（2 ml）使用前先用自來水沖洗，再用蒸餾水漂洗，于80℃烘箱烘干。將標(biāo)簽放入安瓿管上部，滅菌(0.103MPa,30min)，備用。
2.3保護(hù)劑的配制和滅菌
一般常用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑。將甘油配成10%的溶液，滅菌(0.1MPa,30min)，備用；或二甲基亞砜配成5%或10%的溶液，過濾滅菌，備用。
2.4菌種的準(zhǔn)備
將菌種接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂或綜合馬鈴薯培養(yǎng)基平板上，20℃－28℃下培養(yǎng)，待菌絲長滿后，用無菌打孔器從平板上切取大小均勻的小塊（直徑約5-10mm），轉(zhuǎn)入安瓿管中；或在安瓿管中加1.2-2ml的瓊脂培養(yǎng)基，接種，培養(yǎng)2-10天。zui后加1.5ml保護(hù)劑，封口。
2.5凍結(jié)
一般冷凍速度控制在以每分鐘下降1℃為好，使樣品凍結(jié)到-35℃。
目前常用的有三種控溫方法
——程控降溫法：應(yīng)用電子計(jì)算機(jī)程序控制降溫裝置，可以穩(wěn)定連續(xù)降溫，能很好地控制降溫速率。
——分段降溫法：將菌體在不同溫級的冰箱或液氮罐口分段降溫冷卻，或懸掛于冰的氣霧中逐漸降溫。一般采用二步控溫，先將安瓿管或塑料小管置于-20℃至-40℃冰箱中1-2小時(shí)，然后取出放入液氮罐中快速冷凍。這樣冷凍速率大約每分鐘下降1-1.5℃。
——對耐低溫的微生物、可以直接放入氣態(tài)或液態(tài)氮中。
2.6保藏
在氣相中-150℃，液相中-196℃。
2.7保藏時(shí)間
一般10年以上。
2.8轉(zhuǎn)接方法
從液氮罐中取出安瓿管，立即放入38℃-40℃溫水中，快速復(fù)蘇。為了防止污染，用75%酒精洗安瓿管表面，待表面干燥后，用已消毒過的剪刀在安瓿管一端敲開或開啟塑料小管，將內(nèi)容物移至適宜的培養(yǎng)基上，并置于適宜溫度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
2.9ATCC菌種液氮保藏應(yīng)注意事項(xiàng)
—— 防止凍傷，操作注意安全，戴面罩及皮手套；
—— 安瓿管要用圓底的。若用塑料管一定要擰緊管蓋；
—— 運(yùn)送液氮時(shí)一定要用特制的容器，絕不可用密閉容器存放或運(yùn)輸液氮，切勿使用保溫瓶存放液氮；
—— 注意存放液氮容器的室內(nèi)通風(fēng)，防止過量氮?dú)馐谷酥舷ⅲ?/p>
—— 當(dāng)從液氮容器取出安瓿管時(shí)，要特別小心，防止破裂爆炸；
—— 注意觀察液氮容器中液氮的殘存量，定期填充液氮。