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干細胞的軟瓊脂集落培養(yǎng)實驗
閱讀：557 發(fā)布時間：2018-3-22干細胞實驗方法原理
HL-60細胞是一種急性早幼粒細胞白血病細胞，在體外無需加刺激因子，可在軟瓊脂培養(yǎng)基中形成集落。二甲基亞砜是一種細胞分化誘導劑，經(jīng)二甲基亞砜處理后的HL-60細胞按粒系途徑定向成熟分化，同時細胞的增殖力降低，幾乎全部細胞喪失了軟瓊脂中形成集落的能力。因此，這種方法可用于細胞分化的基礎(chǔ)研究和臨床腫瘤治療的療效檢驗等方面。
實驗材料
HL-60細胞
試劑、試劑盒
小牛血清 RPMI1640培養(yǎng)液 臺盼蘭 瓊脂 二甲基亞砜
儀器、耗材
超凈工作臺 二氧化碳培養(yǎng)箱 顯微鏡 培養(yǎng)瓶 吸管 酒精燈 血細胞計數(shù)板 多孔培養(yǎng)板
實驗步驟
1. 收集對數(shù)生長期的HL-60細胞，先按實驗十三測定細胞活力，然后調(diào)整細胞濃度，制成300~1 000活細胞/ml 的細胞懸液。
2. 取二個培養(yǎng)瓶每個瓶中加9 ml 調(diào)整好濃度的細胞懸液，然后各加入1 ml 3%瓊脂（已融化，在65℃水浴中放置），迅速加入，混勻。
3. 用微量加樣器吸140 μl 二甲基亞砜（MDSO），加到一個瓶中，充分混勻，為實驗組，另一瓶不加DMSO，為空白對照組。
4. 取一個16 mm 多孔培養(yǎng)板，每孔加1 ml（35 mm 培養(yǎng)皿需加2 ml）細胞瓊脂懸液，勿有氣泡，將實驗組和對照組分兩組加好，蓋上蓋并作好標記。
5. 在室溫放置20分鐘使細胞瓊脂懸液凝固。
6. 然后移培養(yǎng)板或平皿于CO2培養(yǎng)箱中37℃進行培養(yǎng)。
7. 培養(yǎng)7~10天，肉眼觀察并計數(shù)細胞集落。
8. 結(jié)果：以肉眼可見的細胞團（含500個以上細胞）作為計數(shù)集落的標準。對照組HL-60細胞在含0.3%的軟瓊脂培養(yǎng)基中生長良好，每個孔中可見有多個集落形成，而實驗組HL-60細胞因經(jīng)二甲基亞砜誘導分化，細胞在軟瓊脂中的集落形成明顯減少。
9. 干細胞集落的計數(shù)和計算：
（1）集落數(shù)=n孔中細胞集落數(shù)總和/n孔
（2）集落形成率=集落數(shù)/接種培養(yǎng)細胞總數(shù)×100%
Cladribine Related Compound A 克拉曲濱相關(guān)物質(zhì)A標準品 24757-70-8 20mg
西替利嗪相關(guān)物質(zhì)A標準品 246870-46-2 20mg
Doxazosin Related Compound C 多沙唑嗪相關(guān)雜質(zhì)C標準品 23680-84-4 20mg
依法韋侖相關(guān)物質(zhì)A標準品 209414-27-7 20mg
左沙丁胺醇鹽酸鹽相關(guān)物質(zhì)B標準品 18910-68-4 20mg
Abacavir Sulfate Racemic 外消旋阿巴卡韋標準品 188062-50-2 20mg
Actein 黃肉楠堿標準品 18642-44-9 20mg
左沙丁胺醇鹽酸鹽相關(guān)物質(zhì)G標準品 182676-90-0 20mg
外消旋依法韋侖標準品 177530-93-7 20mg
Dofetilide Related Compound A 多非利特相關(guān)物質(zhì)A標準品 176447-94-2 20mg
干細胞