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人正常組織來源細胞的凍存與復蘇
閱讀：343 發布時間：2017-7-18人正常組織來源細胞為了防止因污染或技術原因使長期培養功虧一簣，考慮到培養細胞因傳代而遲早會出現變異，有時因寄贈、交換和購買，培養細胞從一個實驗室轉運到另一個實驗室，*的策略是進行低溫保存。這對于維持一些特殊細胞株的遺傳特性極為重要。現簡要介紹深低溫保存法(－70℃~－196℃)的特點。細胞深低溫保存的基本原理是：在－70℃以下時，細胞內的酶活性均己停止，即代謝處于*停止狀態，故可以長期保存。細胞低溫保存的關鍵，在于通過0~20℃階段的處理過程。在此溫度范圍內，水晶呈針狀，極易招致細胞的嚴重損傷。
一、細胞的凍存：為避免污染造成的損失，zui小化連續細胞系的遺傳改變和避免有限細胞系的老化和轉化，需要凍存哺乳細胞。凍存細胞前，細胞應該特性化并檢查是否污染。
有幾種普通培養基用來凍存細胞。對于包含有血清的培養基，成分可能如下：
包含10％甘油的*培養基，
包含10％二甲基亞砜（DMSO）的*培養基，
50％ 細胞條件培養基和50％含有10％甘油的新鮮培養基，或
50％ 細胞條件培養基和50％含有10％二甲基亞砜的新鮮培養基。
對于無血清培養基，一些普通的培養基成分可能是：
50％ 細胞條件無血清培養基和50％包含有7.5％二甲基亞砜的新鮮的無血清培養基，或
包含有7.5％二甲基亞砜和10％細胞培養級BSA的新鮮無血清培養基。
1、懸浮細胞
計數將要凍存的活細胞。細胞應該處于對數生長期。以大約200～400g離心5分鐘沉淀細胞，使用移液管移去上清到zui小體積，不要攪亂細胞。
以1×107到5×107細胞/ml密度，在包含有血清的冷凍培養基中再次懸浮細胞，或者以0.5×107到1×1027在無血清培養基中，再次懸浮細胞。
分裝進凍存管，將凍存管置于濕冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內開始冷凍步驟。
細胞以1℃/分鐘進行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉移到液氮中貯存。
2、貼壁細胞
使用分離試劑從基層分離細胞，分離時盡可能溫和，使對細胞的損傷減少到zui小。
在*生長培養基中，再次懸浮分離細胞，確定有活力細胞數。
以大約200g離心5分鐘沉淀細胞。使用移液管移去上清到zui小體積，不要攪亂細胞。
以5×106到1×106細胞/ml密度，在凍存液中懸浮細胞。
分裝進凍存管，將凍存管置于濕的冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內開始冷凍步驟。
細胞以1℃/分鐘進行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉移到液氮中貯存。
二、凍存細胞的復蘇:凍存細胞較脆弱，要輕柔操作。凍存細胞要快速融化，并直接加入*生長培養基中。若細胞對凍存劑（DMSO或甘油）敏感，離心去除凍存培養基，然后加入*生長培養基中。
1、直接鋪板方法
取出貯存細胞，37℃水浴中快速融化。
直接用*生長培養基鋪板細胞。1ml凍存細胞使用10~20ml*生長培養基。進行活細胞計數，細胞接種應該至少在3×105活細胞/ml。培養細胞12到24小時，更換新鮮的*生長培養基，去除凍存劑。
2、離心方法
取出貯存細胞，37℃水浴中快速融化。
把1到2ml凍存細胞加入到大約25ml*生長培養基，輕輕混勻。
以大約80x g離心2到3分鐘。
棄去上清。
在*生長培養基輕輕再次懸浮細胞，并且進行活細胞計數。
細胞鋪板，細胞接種應該至少為3×105活細胞/ml。
三、細胞的分化、衰老與死亡
1、細胞的分化:一個成年人全身細胞總數約1012個，可以區分為200多種不同類型的細胞：形態結構，代謝，行為，功能等各不相同。追根溯源，這么多種細胞均來自一個受精卵細胞。所以，通常把發育過程中，細胞后代在形態、結構和功能上發生差異的過程稱為細胞分化。細胞分化發生在胚胎階段，也發生在胎兒出生以后，乃至成人階段。例如，人體血細胞的產生和分化，這個過程在人的一生中一直持續著。
由旺盛生長不斷分裂的細胞，轉入分化，通常從細胞周期中G1期開始時一個確定的點G0點“逃逸”出細胞周期。旺盛生長分裂的細胞和各種分化了的細胞，它們的基因表達和代謝活動各不相同。
2、細胞的衰老:體外人正常組織來源細胞培養實驗證明：
成纖維細胞：來自胎兒傳代50次后衰老死亡,來自成人傳代20次后衰老死亡(與具體年齡有關);來自小鼠傳代14--28次后衰老死亡,來自烏龜傳代90--125次后衰老死亡。
細胞衰老過程中會發生一系列的變化，包括：蛋白質合成速度降低，已有蛋白質結構變化，特異蛋白質成份出現；同時，細胞核，線粒體，膜系統、骨架系統等都有結構、功能的改變。
細胞衰老原因，尚無定論，出現過好幾種理論與假說，其中得到較廣泛認可的是“自由基損傷假說”。
3、細胞凋亡:細胞的死亡是個體存活的正常現象，常見的細胞死亡形式有3種：壞死、凋亡和細胞毒性。多細胞生物的生命活動中，因為環境因素的突然變化或病原物的入侵，導致一部分細胞死了，稱為細胞的病理死亡，或細胞壞死。壞死是細胞暴露于嚴重的物理或化學刺激時導致的細胞死亡；細胞毒性是由細胞或者化學物質引起的單純的細胞殺傷事件，不依賴于其它兩種細胞死亡機理，如殺傷T細胞的細胞毒性作用。
還有一種情況，一部分細胞的死亡是生物個體正常生命活動（代謝、生長、發育、分化）的一個必要部分；似乎帶有“犧牲局部，保全整體”的意味。這種情況下的細胞死亡，明顯地受遺傳控制，稱為細胞凋亡。 凋亡（Apoptosis）則是程序性的、正常的細胞死亡，是機體清除無用的或者不想要的細胞的手段。它與細胞壞死是兩個截然不同的過程，無論從形態學、生物學還是生化的特征來說，都有明顯的區別。細胞凋亡現象普遍存在于生物界。細胞凋亡與細胞增殖、分化和衰老起著互補與平衡的作用，在多細胞動物的發育、形態建成與維持中扮演至關重要的角色。作為細胞的一種基本生命現象，凋亡失控的結果將是可怕的：凋亡不足時，易發生癌變、病毒性疾病和自身免疫疾病；而凋亡過量則可能產生獲得性免疫缺陷綜合征（HIV）、重癥肝炎與退行性神經疾病，如老年性癡呆癥（Alzheimer's disease）、帕金森氏癥（Parkinson's disease）。因此研究細胞凋亡及其機理具有重要的理論和實踐意義。
細胞凋亡與壞死的區別
壞死 ：
形態學特征-膜完整性喪失，胞漿和線粒體膨脹，全細胞裂解。
生化特征-離子內環境失調：非能量依賴性的（被動過程，在4°C也可以發生），隨機消化DNA（電泳顯示為DNA彌散狀態），Postlytic DNA斷裂。
生理學特征-影響群組細胞：由非生理學因素引起（如補體攻擊、代謝中毒、缺氧等），被巨噬細胞吞噬，周圍有明顯的炎癥反應。
凋亡 ：
形態學特征-胞膜出芽，但保持完整，染色體聚集在核膜周邊，胞漿收縮、細胞核凝集，zui后細胞分裂為凋亡小體，Bcl-2家族蛋白導致線粒體膜通透性增加。
生化特征--ATP依賴性的（主動過程，在4°C不能發生），以核小體為單位剪切DNA（電泳顯示為DNA ladder），Prelytic DNA 斷裂,線粒體釋放多種因子至胞漿中（細胞色素c、AIF），Caspases級聯活化，膜對稱性改變（PS外翻）
生理學特征--只影響人正常組織來源細胞，由生理學刺激誘導（如生長因子缺乏、激素環境改變等），被臨近細胞和巨噬細胞吞噬，無炎癥反應。